细菌的耐药机理及检测方法课件

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,随着抗生素的广泛大量的滥用、介入性治疗、免疫抑制剂应用及某些基础疾病的发生。细菌性感染已是临床重要的常见病，且耐药性和耐药水平越来越高，给疾病的治疗及临床用药造成诸多困难。病原菌对常用抗生素，如,-,内酰胺类、氨基糖甙类和喹诺酮类药物的耐药性尤为突出，及时了解细菌的耐药机制和抗生素的发展及应用对策，对我们预防和治疗细菌性感染、制备新的抗菌药物及控制耐药性的蔓延是非常重要的。,随着抗生素的广泛大量的滥用、介入性治疗、免疫抑制剂应用及某些,1,药物作用机制落后于细菌对抗生素耐药性传播的发展，药物作用机理主要是通过干扰细菌核酸的合成、抑制核糖体的功能、抑制胞壁的合成及叶酸盐的代谢等。细菌对抗生素的耐药机制包括遗传和生化两种方式：,遗传方式包括固有耐药（天然性）和染色体突变产生的耐药或获得新的,DNA,分子；,生化方式是指细菌获得性耐药或质粒介导的耐药，主要包括：产生,B-,内酰胺酶、乙酰基转移酶、腺甘酸酶、磷酸化酶、拓扑异构酶等对药物的灭活作用；依靠菌膜的特性降低药物的通透性；改变抗生素作用的靶位，缩短与药物结合的时间；产生药物代谢的旁路；大量产生青霉素结合蛋白（,PBPS,），降低抗生素的新生力；发展产生耐受；产生抗生素导出泵。,药物作用机制落后于细菌对抗生素耐药性传播的发展，药物作用机理,2,遗传方式,固有耐药,固有耐药具有种属特异性，来源于该细菌固有的自然特性，即本身具有耐药基因存在染色体上，非发酵的,G-,杆菌如绿脓秆菌、醋酸钙不动杆菌、假单胞菌属及大多数,G-,杆菌耐万古霉素和甲氧西林，肠球菌耐头孢菌素，厌氧菌耐氨基糖甙类药物等，这些菌的高度固有耐药性是由于菌体外膜的通透性低与继发的双重耐药机理（诱导产生头孢菌素酶和抗生素导出泵）导致的。,遗传方式固有耐药 固有耐药具有种属特异性，来源于该细菌固,3,染色体突变或获得新的,DNA,分子,突变可发生于,DNA,分子，如结核杆菌的点突变可导致对利福平的耐药，淋球菌的点突变可导致对苯唑西林的耐药；也可发生于质粒和转座子的基因上，如质粒编码产生的超广谱,B-,内酰胺酶（,ESBL,）可能由于,TEM,和,SHV,酶基因的点突变导致的，这些点突变集中于基因的,5,个区域内，残基的突变能改变,B-,内酰胺酶与头孢菌素的结合形成，消除阻遏作用，导致抑制和水解三代头孢菌素，如果酶基因的连续突变可从本质上增强酶的活力，使新一代头孢菌素灭活；某些,DNA,调节区基因的突变可产生头孢菌素酶导致对第三代头孢菌素耐药。,染色体突变或获得新的DNA分子 突变可发生于DNA分子，如,4,耐药性可通过接合、转导和转化在微生物间传递，外源性相关的,DNA,小片段组合为内源性基因几乎都通过自然转化和重组形成，质粒接合传播的方式最普遍，但宿主范围局限，尚未发生可在,G+,和,G-,菌中都能复制的质粒，而转座子的宿主范围较广，可在,G+,和,G-,菌间转移，如染色体内的,AmpC,基因可通过转座子越位至质粒中，使某些细菌获得诱导产生能力极强的,I,型酶，称之为,AmpC,型,ESBLS,株（如肠球菌、克雷伯氏菌、某些肠杆菌科的细菌），是耐药性传播的重要原因之一。,耐药性可通过接合、转导和转化在微生物间传递，外源性相关的DN,5,生化方式,细菌获得性耐药的生化机理主要有以下几种。,1.,酶的灭活作用,通过水解或修饰作用破坏抗生素的活性。,（,1,）,-,内酰胺酶 质粒介导或染色体突变使细菌产生,-,内酰胺酶，可水解破坏,-,内酰胺酶，使,B-,内酰胺类抗生素失活，这是大多数致病菌对此类抗生素产生耐药性的主要机制。目前,B-,内酶胺酶已有,230,余种，包括,TEM,系列酶、,SHV,系列酶、,OXA,系列酶、,PSE,系列酶、头孢菌素酶等，质粒介导的酶在,G-,菌中分布较广，以,TEM-1,最普遍，其次为,OXA-1,。,生化方式细菌获得性耐药的生化机理主要有以下几种。,6,根据分子量、等电点、被抑制谱、对底物的水解谱等将,B-,内酰胺酶又分为,4,类，,类酶由染色体的,AmpC,基因诱导产生，多种需氧,G-,杆菌（如大肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、阴沟杆菌等）可产生此酶；,类酶临床上最为重要，分,5,个亚类（,2a,、,2b-2b,、,2c,、,2d,、,2e,），大多数,G+,菌产生的酶（如,pc1,）属于,2a,亚类，,2b,亚类（如,SHV-1,、,TEM-1,），,2b,亚类（如,TEM-3,、,SHV-2,），,2c,亚类（如,PSE-1,，,PSE-4,）,2d,亚类（如,OXA-1,和,PSE-2,），,2e,亚类（如,FEC-1,）少见，由大部分,G-,菌产生。随着新的,-,内酶胺类抗生素的临床应用，由大部分,G-,菌产生。,根据分子量、等电点、被抑制谱、对底物的水解谱等将B-内酰胺酶,7,随着新的,-,内酶胺类抗生素的临床应用，新的酶类不断产生，近年报道的,ESBL,可能来源于,TEM,和,SHV,酶，由于其有有序列的基因点突变导致的，该酶最早发现于肺炎克雷伯氏菌中，仅局限于少数肠杆菌和肠球菌中，可水解头孢菌素及单酰胺类抗生素，特别表现为相应的产酶菌对头孢噻肟、头孢他啶和氨曲南的耐药，并可引起对其氨基糖甙类抗生素的耐药。,随着新的-内酶胺类抗生素的临床应用，新的酶类不断产生，近年,8,新近研究发现，过量产,TEM,和,SHV,型酶的的细菌具有含锌的,-,内酶胺金属酶，此酶的催化效率极高，不仅存在于窄食假单胞菌中，也偶见于其它细菌，此酶对碳青霉烯类抗生素也有耐药性，且不易受酶抑制剂的影响。,内酰胺酶阳性的嗜血杆菌属、淋球菌和卡他莫拉菌对青霉素、氨苄西林和阿莫西林耐药；,-,内酰胺酶阳性的葡萄球菌和肠球菌对青霉素和乙酰氨基青霉素、羧基青霉素和脲基青霉素耐药。注：只对嗜血杆菌属，淋球菌，卡那莫拉菌、葡萄球菌和肠球菌测定,-,内酶胺酶，不要对肠杆菌科，假单胞菌属及其他需氧,G-,杆菌进行此试验。,新近研究发现，过量产TEM和SHV型酶的的细菌具有含锌的-,9,（,2,）,ESBLs 1983,年由,khothe,在德国发现，,1985,年正式报道，该酶为丝氨酸蛋白酶的衍生物，它是由于,-,内酰胺酶上,1,4,位点氨基酸发生了突变，并可以通过质粒传播，由质粒介导的耐药比由染色体介导的耐药多，它可在不同菌株、菌种或菌属间转移扩散。突变产生的,ESBLs,抗药性广，且在,ESBLS,的质粒上常携带对其它抗生素如氨基糖苷类及氟喹诺酮类的耐药基因，呈多重耐药性。,（2）ESBLs 1983年由khothe在德国发现，1,10,ESBLS,的分类：根据酶的来源可分为,TEM,系列：为,TEM1,、,TEM2,的突变酶，此系列酶等电点一般介于,5.16.5,，绝大多数酶分子量（,MW,）为,29KD,，从,TEM3,起已发现有,TEM-70,，而且还在增加；,SHV,系列：此系列酶的等电点较高，介于,7.08.2,，分子量主要为,29KD,，从,SHV-2,起，现已发现,SHV-12,；非,TEM,和,SHV,系列。如确认为,ESBLs,菌株，不管体外药敏试验的结果如何，对所有青霉素类、头孢菌素类和氨曲南均应报告耐药。此酶对酶的抑制剂如克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦抑制。,ESBLS的分类：根据酶的来源可分为TEM系列：为TEM1、,11,（,3,）,AmpC,酶：,1976,年开始研究，但直到,1990,年由,PaPani Colaoll,等才首先证实了此酶的存在。由染色体介导的,AmpC,酶已发现,50,多种，基因带有调控序列，呈诱导型表达，酶的活性不被克拉维酸、,EDTA,抑制，可被邻氯西林、头孢西丁、,BRL-42715,、,RO47,、,RO48,等抑制剂抑制。携带染色体型,AmPC,基因的细菌主要有肠杆菌科、不动杆菌属、绿脓杆菌等，根据产酶水平的高低和表达方式可分为：野生型，通常所定义的,AmpC,酶属于此型；基础型、低水平非诱导型表达，临床定义不大，如,E.Coli,的染色体型,AmpC,酶；高诱导型，诱导后的产酶水平远高于野生型；去阻遏突变型，持续或半持续高水平产酶。,（3）AmpC酶：1976年开始研究，但直到1990年由Pa,12,由质粒介导的酶可分,5,6,组：弗氏枸橼酸杆菌组有,LAT,型和某些,CMY,型，肠杆菌属有,MIR-1,型和,ACT-1,型，摩根摩根组有,DHA-1,型和,DHA-2,型，气单胞菌组有,MOX,型、,FOX,型和其他,CMY,型等。质粒上的,AmpC,酶基因大小从,7,180kb,。酶分子大小约,38,42KD,，具有,378,386,个氨基酸。高产,AmpC,酶细菌通常对第四代头孢菌（如头孢吡肟）敏感，对碳青霉烯类敏感，对头霉素类（如头孢西汀）耐药，不被酶抑制剂所抑制。如果分离的菌株对三代头孢菌素耐药，且不能被克拉维酸抑制、对泰能敏感、对头孢西汀耐药可初步推断为高产,AmpC,酶的细菌。,由质粒介导的酶可分56组：弗氏枸橼酸杆菌组有LAT型和某些,13,（,4,）,氨基糖甙类灭活酶,双功能的氨基糖甙类灭活酶（,6-N-,氨基糖甙类乙酰转移酶，,2-O-,氨基糖甙类磷酶转移酶）是葡萄球菌和肠球菌高水平耐氨基糖甙类药物的重要机制。此酶在分子不同的区域内存在两种不同的氨基糖甙改造因子，是由,Th4100,转座子内,6-aac-a-2,基因编码合成，该基因可插入,R,质粒及氨基糖甙类抗生素染色体基因中，导致在,G+,菌中氨基糖甙类抗性的快速传播。这种双功能酶与其它抗生素抗性因子无任何基因关联，真核蛋白激酶抑制剂能抑制磷酸转移酶的活性，提示这种双功能酶可能是蛋白质家族中的两种普通结构，为临床提供开发这种功能酶抑制剂的可能。,（4）氨基糖甙类灭活酶 双功能的氨基糖甙类灭活酶（6-N,14,（,5,）乙酰基转移酶 某些细菌（如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠球菌、肺炎球菌及流感嗜血杆菌等）对氯霉素耐药性主要是由于质粒编码产生的乙酰基转移酶所致，该酶使氯霉素转化为无活性的代谢产物，失去抗菌活性。,（5）乙酰基转移酶 某些细菌（如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球,15,（,6,）拓扑异构酶 该酶又称,DNA,旋转酶，由,gyrA,和,gyrB,编码，基因的突变引起靶酶,DNA,旋转酶的改变，使喹诺酮类药物失去抑制此酶的活性，而使细菌获得耐药。基因的突变常位于,60-106,残基区域内，在大肠杆菌中约为第,83,个丝氨酸，金黄色葡萄球菌中为第,84,个丝氨酸。,（6）拓扑异构酶 该酶又称DNA旋转酶，由gyrA和gy,16,2.,菌膜通透性的改变,由于药物的作用，细菌改变了外膜蛋白，使菌体外膜通透性降低，阻碍抗生素进入细菌内膜靶位。外膜通透性降低主要由于膜孔蛋白缺陷、多向性突变、特异性通道的改变及膜脂质双层的改变。常见于假单胞菌、醋酸钙不动杆菌、肠球菌等对,B-,内酰胺类、氨基糖甙类、氯霉素、喹诺酮类抗生素的耐药。,2.菌膜通透性的改变 由于药物的作用，细菌改变了外膜蛋白，,17,3.,改变抗生素的作用靶位,细菌在抗生素的作用下通过产生诱导酶对菌体成分进行化学修饰，使其与抗生素结合的有效部位变异，使药物不敏感，而细菌的生理功能正常。常见的药物有甲氧苄胺嘧啶、磺胺类、氨基糖甙类、氯霉素、喹诺酮类药物。如,DNA,中,A,位点基因的突变导致回旋改变造成喹诺酮类耐药；核糖体,RNA,甲基化抑制红霉素结合；,PBP,的改变导致对,B-,内酰胺类抗生素的耐药，,PBP,的改变主要有,PBP,数量改变或缺失、药物与,PBP,的结合力降低、细菌产生诱导型,PBP,或缓慢结合的,PBP,。,3.改变抗生素的作用靶位 细菌在抗生素的作用下通过产生诱导,18,这种由,PBP,介导的耐药性在,G+,菌中较,G-,菌更常见，最常见于耐甲氧西林的葡萄球菌，主要与,PBP2a,的存在有关，该蛋白是一种转肽酶，负责细胞壁的合成，且由,mecA,基因编码，位于,DNA,外区域,mec,内，受质粒携带的,blaRI-blaI,