血友病研究的进展

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,血友病研究的进展,血友病是由于遗传性凝血因子,VIII,（,FVIII,）和,IX,（,FIX,）基因缺陷，造成血浆,FVIII,和,FIX,含量不足或功能缺陷，引起的一组终生出血的凝血障碍性疾病，包括血友病,A,（,FVIII,缺乏）和血友病,B,（,FIX,缺乏），属,X,性联隐性遗传疾病。,西方国家血友病患病率为,5-10/10,万人口，,我国,2.73/10,万人口。,血友病治疗进展,70,年代,-,有效替代治疗，致残率与死亡率,，寿命由平均,10,岁,接近,正常。,80,年代,-,病毒灭活技术改进，替代治疗安全性,，感染病毒性肝炎，爱滋病,。,90,年代,-,重组凝血因子广泛应用，提高疗效；避免抗体产生与易发生病毒感染的副作用。基因治疗在动物试验中获得成功,在人类的临床初步研究成果为血友病的根治带来曙光。,如何进一步降低血友病患者的死亡率，致残率，出生率，提高患者生存质量是目前工作的重要任务。,一发病机制的研究,FVIII,基因定位于,Xq28,，全长,186kb,，由,26,个外显子和,25,个内含子组成。,已发现约,300,多种基因突变,，基因型与表型密切相关。,点突变，小的基因缺失引起轻度,FVIII,缺乏。终止密码子，大的基因缺失，插入，移位，无义突变往往引起严重的,FVIII,缺乏和临床表型。,FVIII 22,内含子倒位突变引起,FVIII,严重缺乏是,45%,的重型血友病,A,的分子发病机制,。,最近在,1%,的重型血友病,A,中还发现,FVIII,内含子,1,倒位突变。,二基因诊断,（一）直接基因诊断：,确定致病基因；携带者检出和产前诊断。,采用,PCR,，,DGGE,，,SSCP,，,DNA,测序等方法直接测定致病基因的缺陷。,FVIII 22,内含子倒位分析可作为重型,HA,的筛选试验，是目前唯一用于临床诊断的直接基因检测方法。,FVIII 22,内含子倒位和其它一些基因突变常伴有抑制物发生，因此有助于预测抑制物的产生。,（二）间接基因诊断,利用致病基因内外的限制性片段长度多态性（,RFLP,）作为特异分子遗传标志物，通过家系成员间的连锁关系确定血友病基因的遗传情况，进行,DNA,多态性分析的遗传学诊断,(RFLP,，,VNTR,，,STR,等方法,),，联合多个,RFLP,，诊断率达可达,99%,。,RFLP,分析的局限性：须具有先证者的标本；母亲系该多态位点的杂合子，联合多个,RFLP,。,（三）高危胎儿产前诊断,妊,9-12,周：绒毛膜活检获取胎儿,DNA,。,妊,12-16,周：养水穿刺。,胚胎植入前：,早期胚胎（,8,个细胞），通过,DNA,基因型和遗传表型确定胎儿性别，是否为血友病或携带者。,妊,18-20,周：胎儿镜下取脐静脉血，测定,VIII:C/FVIII:Ag,。流产危险（约,0.5%-1%,）。,早期，无创性产前诊断,：,FACS,测定母体静脉血中的胎儿特异性单克隆抗体以确定胎儿性别。,三替代治疗,目前最有效的治疗手段。主张尽早治疗，将凝血因子提高到止血水平，避免出血并发征，防止功能丧失。,（一）人,FVIII,浓缩物：近,15,年随着病毒灭活技术的改进（干热法,-HIV,，有机溶剂加表面活性剂方法,-HCV,，二步病毒灭活法,-HAV,），血浆筛选的规范化（,PCR,），血制品的安全性大大提高，血源传播性疾病如肝炎，爱滋病发生率明显降低。,FVIII,浓缩物,中纯度,：含,FVIII 1-3U/mg,，每,1U/kg,可使血浆,FVIII,水平提高,2%,，,含,VWF,，也可用于,VWD,。体内半寿期为,8-12,小时。副作用：病毒感染，抗,FVIII,抑制物产生。,高浓度：含,FVIII 50-200U/mg,，利用层析技术制备，不含,VWF,。,超高纯度：含,FVIII 3000U/mg,，利用离子交换层析或单克隆抗体技术制备，不含,VWF,，,用于,FVIII,抑制物,(,中高滴度,10-30BU),的治疗。,（二）重组,FVIII,浓缩物（,rFVIII,）,基因克隆技术表达，生物活性，半寿期与血浆,FVIII,相似，安全，无病毒污染。价格昂贵，也可产生抗体。加拿大与爱尔兰几乎所有,HA,，美国,70%,重型,HA,采用。,主要用于重型血友病,A,和抑制物的治疗,。,第一代（全长,FVIII,）：人体白蛋白为稳定剂。,第二代（,BDD,）：蔗糖为稳定剂，,FVIII,无,B,区，但仍保留其活性，无免疫活性，更安全，有效。,第三代：鼠单抗，不含人和动物蛋白。,转基因方法生产的人血浆制品的产量将大幅度提高，有望满足全世界血友病患者的需要。,（三）猪,FVIII,浓缩物,抑制物对猪,F,的亲和性比对人,F,亲和性差，不易与人,F,抗体发生交叉反应,，用于高反应型抑制物且严重出血患者的治疗。约,30%,产生抗猪,F,抗体，造成耐药。,开始足量，迅速降低抗体，抗体滴度,30U,：,100-150u/kg,。,重组人,-,猪,F,混合物,利用抗原性较弱的无,B,区的猪,FVIII,序列替代人,FVIII A2,，活化的肽,-A3,和,C2,序列，以降低免疫原性与抗原性，可望成为治疗抑制物的新制剂。,（,四）,FVIII,旁路制剂,-,不依赖,FVIII/FIX,绕开内源性凝血途径，通过补充外源或共同凝血途径中所需的凝血因子同样可达到凝血终点。,（,1,）凝血酶原复合物,(PCC),：含,FII,，,FIX,，,FX,和,FVII,，治疗,HB,；,FVIII,抑制物出血的治疗，,75-125U/kg/,次，有效率,50-60%,。可引起,血栓,。,（,2,）激活的凝血酶原复合物,(APCC),：用于产生抑制物的血友病,A,出血的治疗，有效率,40%-60%,。,50-75U/kg,，,q8-12h,。血栓发生率为,1%-2%,，反复大量使用，肝脏病，抗凝血酶缺乏时易发生，如用,3-4,次无效，不应再用。,1,）,重组激活的,FVIIa(rVIIa),直接或与受损部位的,TF,结合成复合物,与暴露在激活的血小板表面带负电荷的磷脂结合后，直接激活,FXa,；还可激活,FIX,FIXa,，促进凝血酶形成，使纤维蛋白原,纤维蛋白，达到局部止血。这种,酶促反应局限在细胞表面，可能降低了全身凝血活化和血栓并发症的危险,。,推荐剂量为,90ug-120ugkg,-1,，静脉注射，,q2-3h,重复,2-4,次，有效率,80%-90%,，安全。注射局部可形成血栓性静脉炎，极少发生血栓与,DIC,。主要用于抑制物，手术出血的治疗。,五其它治疗,（一）,DDAVP(,弥凝,Stimate),1-,精氨酸,-8-,血管加压素，介导,FVIII,，,VWF,，纤溶酶原激活物从内皮细胞迅速释放到循环中，释放的,VWF,结合,FVIII,，使,FVIII,增高约,2-3,倍。,80,年代,HIV,流行时在意大利广泛应用，避免生物制剂病毒感染，抗体产生。,剂量：,0.3-0.4ug/kg+30mlNS,，,15-30iv,；,ivgtt,；鼻饲。副作用：面色发红，心率加快，轻度头痛，鼻塞。,适应征：轻型,HA,，携带者和,1,型,VWD,首选。重型,HA,和,2,型,VWD,无效。禁忌征：,2B,型和假性,VWD,。心绞痛，心衰，妊娠禁用。,5,岁以下儿童慎用。,血友病治疗指南（,Hemophilia 2003,，,9,）,1,接受血制品前：皮下接种甲，乙肝疫苗。,2,轻型,HA,首选,DDAVP+,抗纤溶，避免血制品。,3 HA,首选,rFVIII,FVIII,；,HB,：,rFIX,；,避免,PCC,。,4,献血员常规查抗,HIV,，,HCV,，,HBsAg,；混合血浆,测,DNA,，减少病毒污染。,5 HA,发生抑制物,25-28%,；,HB 1-3%,，,1/2,过敏反应。,6 PCC,和,rFVII,偶可引起血栓并发症。,7,新鲜冰冻血浆含异凝集素，需血型相合；,冷沉淀物含,FVIII,，,vWF,，,Fg,，,FXIII,，未经病毒,灭活。,放射性同位素治疗血友病早期滑膜炎,反复关节腔内出血刺激滑膜增生，炎性细胞浸润，释放溶酶体破坏软骨，引起滑膜炎症，形成血友病关节炎，影响受累关节功能，最终功能丧失，残废。积极治疗早期滑膜炎对于控制血友病关节残废具有重要意义。,关节镜滑膜切除等手术治疗：患者痛苦，需麻醉，充足的替代治疗，费用高。,近年国外广泛开展同位素治疗血友病出血性滑膜病变。优点：简单，损伤小，术后恢复快，只需少量替代治疗，费用低。上海，北京，佛山已有报道。,原理与方法,早期慢性滑膜炎的非手术治疗经验来自放射性同位素治疗风湿性关节炎。利用,射线“切除”增殖的滑膜和血管，可减少关节出血率，促进功能恢复。,采用,32,P,或,188,铼关节腔内注射，放射性同位素引起关节中滑膜结缔组织纤维化，部分毛细血管闭塞，出血减少，延缓关节病变的进展。,方法与适应征,疗效：接近关节镜滑膜切除，约,80%,，出血程度减轻，频率减少。,适应征：,关节反复出血，,6,个月内出血超过,3,次；,无明显关节软骨及骨质破坏，关节功能,I-II,级，,替代治疗不能有效止血的血友病患者,5,岁以下儿童慎用。,存在问题：远期疗效？同位素的选择？病例的选择？,（三,),血友病的继发性疾病,病毒感染：,1985,年以前多数接受浓缩物治疗的血友病患者感染,HIV,，,HBV,，,HCV,，直至近几年献血员筛选及病毒灭活得到改善。,1,肝脏病变：,HCV,，,HBV,感染发展成慢性活动性肝炎，慢性迁延性肝炎（,50%,），肝硬化（,10%-20%,），肝癌发生率高于一般人群,30,倍。肝功能衰竭是血友病患者死亡重要原因之一。,HCV,治疗同非血友病患者的肝炎，,干扰素,+,病毒唑，约,1/2,获得长期缓解。国外对少数失代偿性肝硬化血友病患者进行肝移植，移植的肝脏产生一定的,FVIII/FIX,，血友病同时得到改善。,2,获得性免疫缺陷病（,AIDS,）,1978-1985,年，,90%,重型,HA,感染,HIV,，,AIDS,成为血友病死亡的主要原因（占,65%,）。,HIV,感染引起继发性免疫缺陷，卡波氏瘤增加,200,倍，非霍奇金淋巴瘤增加,29,倍。,1985,年以来，随着严格献血员筛选，病毒检测及病毒灭活技术（加热法，有机溶剂加表面活性剂，亲和层析法，二步法病毒灭活）的不断改进，现已基本消除感染,HIV,的危险。治疗同其它非血友病,AIDS,患者。,二伴有抑制物血友病,A,的治疗,-,个体化，经验性治疗,F,抑制物是临床最常见的引起出血的凝血因子抑制物,1940,年报告了首例获得性血友病。,80,年代以前，伴有抑制物的血友病患者治疗棘手，死亡率较高。目前随着,F“,旁路制剂”的应用，使患者的预后大大改观。,抑制物产生的流行病学与危险因素,HA,患者接受含有,F,的血制品替代治疗后产生的特异性抑制或灭活,F,促凝活性的抗体，发生率占,HA 20%-30%,，,95%,的抑制物发生在中重型。抑制物产生的平均时间为暴露于抗原后,50,天内（中位数,9-11,天）。,1/3,抑制物为一过性，无临床意义。,80%,为高反应型。多发生于儿童（,10,岁以前）。有阳性家族史，某些种族（如非洲人种），免疫应答反应强者发生抑制物危险性较高。,抑制物产生与基因关系密切,大片断基因缺失（,30%,），无义突变（,25%,）；,22,内含子基因倒位和终止密码子引起,F,蛋白缺失（,35%,），小的基因缺失，错义突变，剪切点突变致,F,蛋白存在,但活性丧失，这种抑制物的发生率仅占,5%-10%,。因此可见，,基因突变类型可成为临床预测抑制物发生的危险因素之一。,抑制物产生机制,较重要的突变往往缺乏,FVIII,抗原（,CRM-,），重型,HA,基本无,FVIII,蛋白的合成与分泌，替代治疗的,FVIII,则成为异体蛋白（抗原），诱导免疫反应，产生