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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节,蛋白质的提取和分离,第一节 蛋白质的提取和分离,课程标准,1,尝试蛋白质的提取和分离。,2,以动物血清为材料，提取其中的乳糖脱氢酶并分离其,同工酶。,课标解读,1,简述蛋白质提取和分离的基本方法和基本原理。,2,尝试血清蛋白等的提取和电泳分离。,课程标准,将生物体内的蛋白质提取出来并加以分离，就可以得到,_,、甚至是,_,的蛋白质。目前常用的蛋白质分离提纯技术，包括,_,技术、,_,技术和,_,技术等。其中，,_,技术最为快捷灵敏、简便易行。,提取和分离蛋白质的方法原理,1,提取和分离蛋白质的方法,高纯度的,单一种类,离心,层析,电泳,电泳,提取和分离蛋白质的方法原理1提取和分离蛋白质的方法高纯度的,(1),概念,蛋白质含有游离的,_,和,_,，是,_,电解质，在一定,_,条件下带有电荷，在电场中可以向与其自身所带电荷,_,的电极方向移动，这就是电泳现象。,(2),原理,蛋白质所带的电荷数,_,，移动,_,；电荷数相同时，相对分子质量,_,，移动,_,。,(3),结果,不同蛋白质的混合溶液，经,_,电泳后，会在,_,上形成不同的,_,。,2,电泳技术,氨基,羧基,两性,pH,相反,越多,越快,越小,越快,同一个电场,凝胶,带纹,2电泳技术氨基羧基两性pH相反越多越快越小越快同一个电场凝,洗脱法分离蛋白质利用的原理是什么？它与电泳技术的原理有何不同？,提示,洗脱法是依据蛋白质分子质量大小，利用凝胶色谱柱使大分子蛋白质优先洗脱出来，而小分子蛋白质后分离出来，称为凝胶色谱法。而电泳法技术则是依据各种分子带电性质的差异，以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现在电场中将各种分子分离。,思维激活,1,洗脱法分离蛋白质利用的原理是什么？它与电泳技术的,(1),蛋白质的性质,蛋白质含有游离的氨基和羧基，是两性电解质，在一定,pH,条件下带有电荷。,(2),电泳现象,作为带电粒子，蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相反的电极方向移动，这就是电泳现象。,(3),电泳原理,蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快；电荷数相同时，相对分子质量越小，则移动越快。,1,电泳技术分离蛋白质的原理,1电泳技术分离蛋白质的原理,(1),聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺,(Acr),和交联剂,N,，,N,甲基双丙烯聚酰胺,(Bis),聚合而成。,Acr,和,Bis,单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应戴手套，避免接触皮肤，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。采用不同浓度的,Acr,、,Bis,、,Ap,、,TEMED,使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此，可按分离物质的大小、形状来选择凝胶浓度。,(2),电泳结果,2,聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果及其鉴定,2聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果及其鉴定,不同的蛋白质的混合溶液，在经过同一个电场电泳后，会在凝胶上形成不同的带纹。每一种带纹可能就是一种蛋白质。,(3),结果鉴定,将带纹一个一个地剪下来，分别予以洗脱，然后对洗脱液中蛋白质做进一步的分离。如果不能再分离，则这个带纹中很可能含有一种单纯蛋白质；如果还能再分离，则这个带纹中含有多种蛋白质，需要作进一步分离，直至提纯。,不同的蛋白质的混合溶液，在经过同一个电场电泳后，会在凝胶上形,电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷,_,方向的电极移动,(,),。,A,相同,B,相反,C,相对,D,相向,解析,在一定,pH,作用下，生物大分子中有某些可解离的基团，这些基团会带上正电荷或负电荷，在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。,答案,B,【,巩固,1,】,电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷_,(1),点样：样品的成分包括,_5 L,、与质量浓度为,0.4 g/mL,的,_,溶液及质量分数为,0.1%,的,_,指示剂,_,混匀后，用,_,吸取样品加到电泳样品槽的,_,上。,(2),电泳：打开电源，将电流调节至,_mA,，待样品进入分离胶后，改为,_mA,。当溴酚蓝前沿距离硅胶框下缘,_,时，将电流调回零，关闭电源。,提取和分离蛋白质的过程,1,血清蛋白的提取和分离,新制血清,蔗糖,溴酚蓝,等体积,微量加样器,胶面,10,20,30,1 cm,提取和分离蛋白质的过程1血清蛋白的提取和分离新制血清蔗糖溴,(3),染色：将凝胶放入质量分数为,_,染色液中染色,_min,。,(4),脱色：用体积分数为,_,溶液浸泡漂洗数次，每隔,_h,更换一次脱色液。,(5),制干胶板：可获得血清蛋白的,_,。,(1),加拿大科学家班廷等人发现和提纯了,_,，救助了数千万的糖尿病患者。,(2),在癌变检测中，现在只需从早期患者的,_,、,_,或,_,中提取少量蛋白质样品，采用,_,技,术，就可以更加快速、简便、准确地对,_,作出诊断。能够提前,3,5,年发现一些,_,，从而为患者做出及时的肿瘤预警，争得更多宝贵的治疗时间。,2,蛋白质提取与分离的实践意义,0.05%,的考马斯亮蓝,R,250,30,7%,的醋酸,1,2,电泳谱带,胰岛素,尿液,血液,细胞裂解液,蛋白质指纹图谱,细胞癌变,变异基因,(3)染色：将凝胶放入质量分数为_,除了上述分离方法，你还知道哪种方法可以分离蛋白质？它依据的原理是什么？,提示,透析法。依据的原理是半透膜只允许小分子透过，不允许大分子透过。,思维激活,2,除了上述分离方法，你还知道哪种方法可以分离,血清蛋白的提取与分离,(1),点样：取新制血清,5 L,、与质量分数为,0.4 g/mL,蔗糖溶液及质量分数为,0.1%,的溴酚蓝指示剂等体积混合均匀后，用微量加样器取,5 L,样品，小心地将样品加到样品糟的胶面上,(,如下图所示,),。,血清蛋白的提取与分离,(2),电泳：将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接,(,方向切勿接错,),；接通冷却水，打开电泳仪开关。开始时将电流调至,10 mA,，待样品进入分离胶时，将电流调至,20,30 mA,。当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘,1 cm,时，将电流调回到零，关闭电源。,(3),染色：将凝胶放入,0.05%,考马斯亮蓝,R,250,染色液中，使染色液没过胶板，染色,30 min,左右。,(4),脱色：用,7%,醋酸浸泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去。如用,50,水浴或脱色摇床，则可缩短脱色时间。,(5),制干胶板：将已脱色的凝胶板放在保存液中浸泡,3,4 h,，,然后将凝胶板放在两层透气玻璃纸中间，自然干燥即可获得血清蛋白的电泳图谱，如下图所示。,(2)电泳：将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接,特别提醒,分离胶和浓缩胶单独存在时具有神经毒性，应避免接触皮肤。,特别提醒 分离胶和浓缩胶单独存在时具有神经毒性，应避免接触皮,下列关于点样的叙述正确的是,(,),。,A,点样液是血清和溴酚蓝指示剂等体积混合液,B,点样需用微量加样器,C,点样液是指新鲜血清,D,点样液可在市场上购买,答案,B,【,巩固,2,】,下列关于点样的叙述正确的是 ()。【巩固2】,下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离的原因,(,),。,A,分子带电性质的差异,B,分子的大小,C,分子的形状,D,分子的变性温度,思维导图：,【,例,1,】,示例,一,提取和分离蛋白质的原理,下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离的,深度剖析,电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程，样品分子的带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子的变性温度无关，故正确答案选,D,项。,答案,D,深度剖析电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程，样品分,归纳提升,蛋白质的分离方法及相关原理比较：,方法,原理,凝胶色谱法,根据相对分子质量的大小分离蛋白质,电泳法,根据各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同进行分离,归纳提升 蛋白质的分离方法及相关原理比较：方法原理凝胶色谱法,用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离和提取血清蛋白的实验操作中，错误的是,(,),。,A,点样时将样品小心加到电泳样品槽的胶面上,B,电泳时，将稳压稳流电泳仪的电流稳定在,10 mA,C,染色时用,0.05%,考马斯亮蓝,P,250,染色液,D,脱色用,7%,醋酸浸泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去,思维导图：,【,例,2,】,示例二,提取和分离蛋白质的过程,用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离和提取血清蛋白的实验,深度剖析,用聚丙烯酰胺凝胶电泳法提取分离蛋白质的操作顺序为：点样,电泳,染色,脱色,制干胶板。点样用微量加样器取,5 L,样品，加到样品槽的胶面上。电泳时，打开电泳仪开关将电流调至,10 mA,，待样品进入分离胶时，将电流调至,20,30 mA,。当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘,1 cm,时，将电流调回到零，关闭电源。,答案,B,深度剖析用聚丙烯酰胺凝胶电泳法提取分离蛋白质的操作顺序为：,凝胶色谱法的原理,利用凝胶色谱法分离蛋白质,技法必备,蛋白质的,分离原理,根据蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用来进行分离,蛋白质分子运动情况,类型,相对分子质量大,相对分子质量小,大小,直径较大,直径较小,方向,垂直向下运动,无规则扩散,速度,较快,较慢,路径,较短,较长,洗脱次序,先流出,后流出,凝胶色谱法的原理利用凝胶色谱法分离蛋白质技法必备,下图是凝胶色谱法分离蛋白质的原理示意图，据图回答下列问题：,能力展示,下图是凝胶色谱法分离蛋白质的原理示意图，据图回答下列问题：能,(1),图中,A,表示的含义是：相对分子质量较小的蛋白质,_,；相对分子质量较大的蛋白质,_,。,(2),图中,B,表示的凝胶色谱法分离蛋白质的过程，指出图中各自的含义：,_,；,_,；,_,；,_,；,_,。,(1)图中A表示的含义是：相对分子质量较小的蛋白质_；,解析,本题主要是对识图能力考查。图中,A,表示相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶层时扩散的特点，,B,表示蛋白质混合液通过凝胶色谱柱被洗脱的过程。,答案,(1),因扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过,(2),蛋白质混合物上柱,洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内部；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于颗粒之外,相对分子质量较小的蛋白质被滞留，相对分子质量较大的蛋白质向下移动,相对分子质量不同的分子完全分开,相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中,解析本题主要是对识图能力考查。图中A表示相对分子质量不同的,下列关于电泳概念的理解，错误的是,(,),。,A,能进行电泳的物质一般是带电颗粒,B,带电颗粒向着与其电性相同的电极移动,C,影响电泳速度的因素包括带电颗粒的性质、电场强,度、溶液的,pH,等,D,电泳支持物有滤纸、大分子凝胶、醋酸纤维薄膜等,解析,电泳是指带电颗粒向着与其电性相反的电极移动的现象。,答案,B,1.,下列关于电泳概念的理解，错误的是 ()。1.,电泳过程中，什么样的分子迁移速度最快,(,),。,A,纤维状、大分子,B,纤维状、小分子,C,球状、大分子,D,球状、小分子,解析,电泳就是利用了分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同而分离各种分子的。一般来说，球形分子比纤维状分子易移动，小分子比大分子易移动。,答案,D,2,电泳过程中，什么样的分子迁移速度最快 ()。2,(1),目前常用的蛋白质分离提纯技术，包括,_,、,_,和,_,等。其中，,_,最为快捷灵敏、简便易行。,(2),蛋白质含有游离的,_,和,_,，是,_,电解质，在一定,pH,条件下带有电荷。,答案,(1),离心技术层析技术电泳技术电泳技术,(2),氨基羧基两性,3,(1)目前常用的蛋白质分离提纯技术，包括_、_,课堂小结
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