分离工程--第四章PPT

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,10.1,反胶束溶液形成的条件和特性,优点：从所得结果来看，反胶束萃取具有本钱低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率都很高等突出的优点。此外，反胶束萃取还有可能解决外源蛋白的降解，即蛋白质(胞内酶)在非细胞环境中快速失活的问题，而且由于构成反胶束的外表活性剂往往具有溶解细胞的力量，因此可用于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。可见，反胶束萃取技术为蛋白质的分别提取开拓了一条具有工业开发前景的新途径。,反胶束溶液的概念：反胶束溶液是透亮的、热力学稳定的系统。反胶束(reversed micelle)是外表活性剂分散于连续有机相中一种自发形成的纳米尺度的聚拢体，所以外表活性剂是反胶束溶液形成的关键。,10.1.1 外表活性剂,外表活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两局部组成的两性分子，可分为阴离子外表活性剂、阳离子外表活性剂和非离子型外表活性剂，它们都可用于形成反胶束。常用的外表活性剂及相应的有机溶剂见表10.1。,在反胶束萃取蛋白质的争论中，用得最多的是阴离子外表活性剂AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸2乙基己基磺酸钠，构造式见图,这种外表活性剂简洁获得，其特点是具有双链，极性基团较小、形成反胶束时不需加助外表活性剂，并且所形成的反胶束较大，半径为170nm，有利于大分子蛋白质进入。常使用的阳离子外表活性剂名称和构造如下：,(1),CTAB(cetyl-methyl-ammonium bromide),溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴,(2),DDAB(didodecyldimethyl ammonium bromide),溴化十二烷基二甲铵,(3,)TOMAC(triomethyl-ammonium chloride),氯化三辛基甲铵,将阳离子外表活性剂如CTAB溶于有机溶剂形成反胶束时，与AOT不同，还需参加肯定量的助溶剂(助外表活性剂)。这是由于它们在构造上的差异造成的。,临界胶束浓度,(,Critical Micelle Concentration CMC),临界胶束浓度,是胶束形成时所需外表活性剂的最低浓度，用CMC来表示，这是体系特性，与外表活性剂的化学构造、溶剂、温度和压力等因素有关。CMC的数值可通过测定各种物理性质的突变(如外表张力、渗透压等)来确定。由于试验方法不同，所得的CMC值往往难于完全全都，但是突变点总是落在一个很窄的浓度范围内，故用CMC范围来表示更为便利。,10.1.3,胶束与反放束的形成,将外表活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度(CMC)时，外表活性剂就会在水溶液中聚拢在一起而形成聚拢体，在通常状况下，这种聚拢体是水溶液中的胶束，称为正常胶束(normal micelle)。构造示意见图a。在胶束中，外表活性剂的排列方向是极性基团在外，与,水接触，非极性基团在内，形成一个非极性的核心、在此核心可以溶解非极性物质。假设将外表活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度(CMC)，便会在有机溶剂内形成聚拢体，这种聚拢体称为反胶束，其构造示意见图b。在反胶束中，外表活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核(po1ar core)。此极性核具有溶解极性物质的力量，极性核溶解水后，就形成了“水池”(water pool)。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水物质能够通过螯合作用进入此“水池”。由于四周水层和极性基团的爱护，保持了蛋白质的自然构型，不会造成失活。蛋白质的溶解过程和溶解后的状况示意于图中。,b,a,c,反胶团的大小与溶剂和外表活性剂的种类与浓度、温度、离子强度等因素有关，一般为520nm，其内水池的直径d用下式计算,d=,6W,0,M,surf,N,W0有机相中水与外表活性剂的摩尔比，称为含水率water content,M，,分别为水的相对分子质量和密度,surf界面处一个外表活性剂分子的面积,N,阿佛加德罗常数,常用于制备反胶团溶液的外表活性剂是二(2乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠，AOT在异辛烷中形成的反胶团直径(d)可用下述阅历式推算,d=0.3W,0,+0.24 (nm),式中右侧第一项为反胶团的水核直径，其次项(2.4nm)为AOT分子长度的二倍。一般反胶团的W0不超过40。因此，AOT形成的反胶团水核直径一般不超过l 2nm，其中大致可容纳一个直径为510 nm的蛋白质。当蛋白质分子与反胶团直径相比大得多时(例如，当相对分子质量超过100200kD)，难于溶解到反胶团中。当反胶团的含水率W0较低时，反胶团水池内水的理化性质与正常水相差悬殊。例如，以AOT为外表活性剂，当W06-8时，反胶团内微水相的水分子受外表活性剂亲水基团的猛烈束缚，表观粘度上升50倍，疏水性也极高。随W0的增大，这些现象渐渐减弱，当W016时，微水相的水与正常的水接近，反胶团内可形成双电层。但即使当W0值很大时，水池内水的理化性质也不能与正常的水完全一样，特殊是在接近外表活性剂亲水头的区域内。,10.1.4,反胶团的溶解作用,由于反胶团内存在微水池，故可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子，为生物分子供给易于生存的亲水微环境。因此，反胶团萃取可用于氨基酸、肽和蛋白质等生物分子的分别纯化，特殊是蛋白质类生物大分子。关于反胶团溶解蛋白质的形式，有人提出了四种模型，如下图。其中(a)为水壳模型，蛋白质位于水池的中心，四周存在的水层将其与反胶团壁(外表活性剂)隔开；(b)蛋白质分子外表存在猛烈疏水区域，该疏水区域直接与有机相接触；(c)蛋白质吸附于反胶团内壁；(d)蛋白质的疏水区与几个反胶团的外表活性剂疏水尾发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解”。外表性质不同的蛋白质可能以不同的形式溶解于反胶团相，但对于亲水性蛋白质，目前普遍承受的是水壳模型。,由于很多试验数据均间接地证明白水壳模型的正确性。例如：(1)反胶团内酶的构造和活性与W0值亲密相关，说明酶对其四周存在的水层特别敏感；(2)反胶团内酶反响动力学行为与在正常的水相中相像，活性与pH的关系同样表现为钟状曲线。,b,c,d,a,反胶团的溶解作用,10.2 反胶束萃取蛋白质的根本原理,三元相图及萃取蛋白质,对一个由水、外表活性剂和非极性有机溶剂构成的三元系统，存在有多种共存相，可用三元相图表示，图是水AOT异辛烷系统的相图例如，从图中可知，能用于蛋白质分别的仅是位于底部的两相区，在此区内的三元混合物分为平衡的两相：一相是含有极少量有机溶剂和外表活性剂的水相；另一相是作为萃取剂的反胶束溶液。这共存的两相组成，用系线(图中虚线)相连。这一体系的物理化学性质特别适合于萃取操作，由于界面张力在0.12mN/m范围内，密度差为10-20，反胶束溶液粘度适中，大约为1mPas这一数量级。蛋白质进入反胶束溶液是一种协同过程，即在宏观两相(有机相和水相)界面间的外表活性剂层，同邻近的蛋白质发生,静电作用而变形，接着在两相界面形成了包含有蛋白质的反胶束，此反胶束集中进入有机相中，从而实现了蛋白质的萃取，其萃取过程和萃取后的状况见图，转变水相条件(如pH值和离子种类及其强度等)又可使蛋白质由有机相重新返回水相实现反萃取过程。,水,AOT,异辛烷系统相图,反胶束萃取蛋白质的示意团,蛋白质溶入反胶束溶液的推动力与安排特性,蛋白质溶入反胶束溶液的推动力主要包括外表活性剂与蛋白质的静电作用力和位阻效应。(1)静电作用力：在反胶束萃取体系中，外表活性剂与蛋白质都是带电的分子，因此静电相互作用确定是萃取过程中的一种推动力。其中一个最直接的因素是pH值，它打算了蛋白质带电基团的离解速率及蛋白质的净电荷。当pHpI时，蛋白质呈电中性；pHpI时，蛋白质带正电荷；pHpI时，蛋白质带负电荷，即随着pH的转变，被萃取蛋白质所带电荷的符号和多少是不同的。因此，假设静电作用是蛋白质增溶过程的主要推动力，对于阳离子外表活性剂形成的反胶束体系，萃取只发生在水溶液的pHpI时，此时蛋白质与外表活性剂极性头间相互吸引，而pHpI时，静电排斥将抑制蛋白质的萃取，对于,推动力,阴离子外表活性剂形成的反胶束体系，状况正好相反。此外，离子型外表活性剂的反离子并不都固定在反胶束外表，对于AOT反胶束，约有30的反离子处于解离状态，同时，在反胶束“水池”内的离子和主体水相中的离子会进展交换，这样，在萃取时会同蛋白质分子竞争外表活性剂离子，从而降低了蛋白质和外表活性剂的静电作用力。另一种解释则认为离子强度(盐浓度)影响蛋白质与外表活性剂极性头之间的静电作用力是由于离解的反离子在外表活性剂极性头四周建立了双电层，称为德拜屏蔽，从而缩短了静电吸引力的作用范圈，抑制了蛋白质的萃取，因此在萃取时要尽量避开后者的影响。,(2)位阻效应 很多亲水性物质，如蛋白质、核酸及氨基酸等，都可以通过溶入反胶束“水池”来到达它们溶于非水溶剂中的目的，但是反胶束“水池”的物理性(大小、,外形等)及其中水的活度是可以用W0的变化来调整的，并且会影响大分子如蛋白质的增溶或排斥，到达选择性萃取的目的，这就是所谓的位阻效应。,反胶束萃取中蛋白质的安排特性,蛋白质在两相间的安排系数,反胶束浓度M与外表活性剂浓度Ssurf的关系为,M=,S,surf,/N(N,为聚焦数),反胶束萃取蛋白质的动力学,萃取过程中，蛋白质在互不相溶的两相间的传递可分为三步：蛋白质从水溶液主体集中到界面；在界面形成包涵蛋白质的反胶束；含有蛋白质的反胶束在有机相中集中离开界面。反萃取过程则相反，含有蛋白质的反胶束从有机相主体集中到界面；包涵蛋白质的反胶束在界面崩裂；蛋白质从界面集中到水溶液主体。蛋白质进入或离开反胶束相的传递通量可用下式计算：,萃取过程,反萃取过程,10.3,影响反胶束萃取蛋白质的主要因素,上式,上式,蛋白质的萃取，与蛋白质的外表电荷和反胶束内外表电荷间的静电作用，以及反胶束的大小有关，所以，任何可以增加这种静电作用或导致形成较大的反胶束的因素，都有助于蛋白质的萃取。影响反胶束萃取蛋白质的主要因素，见下表，只要通过对这些因素进展系统的争论，确定最正确操作条件，就可得到适宜的目标蛋白质萃取率，从而到达分别纯化的目的。,水相pH值对萃取的影响,水相的pH值打算了蛋白质外表电荷的状态、从而对萃取过程造成影响。只有当反胶束内外表电荷，也就是外表活性剂极性基团所带的电荷与蛋白质外表电荷相反时，两者产生静电引力，蛋白质才有可能进入反胶束。故,对于阳离子外表活性剂、溶液的pH值需高于蛋白质的pI值，反胶束萃取才能进展；对于阴离子外表活性剂，当pHpI时，萃取率几乎为零，当pHpI时，萃取率急剧提高，这说明蛋白质所带的净电荷与外表活性剂极性头所带电荷符号相反，两者的静电作用对萃取蛋白质有利，假设pH值很低，在界面上会产生白色絮凝物，并且萃取率也降低这种状况可认为是蛋白质变性之故。水相pH值对几种相对分子质量较小的蛋白质的萃取影响见图。对不同相对分子质量的蛋白质，pH值对萃取率的影响有差异性，当蛋白质相对分子质量增加时，只有增大(pH-PI)值确实定值，相转移才能顺当完成，如-糜蛋白酶(相对分子质量为25000)的萃取率在pH值低于pI值2-4时到达最高，而牛血清蛋白(相对分子质量为68000)在一样的系统中根本不发生相转移。这种差异性可解释为：对于包含大蛋白分子的反胶束，其尺寸,远大于“空核”的反胶束，萃取时势必要消耗较多的能量，这些能量只能通过较强的静电相互作用得到补偿。用调整pH的作用来增加蛋白质分子外表电荷的方法，正是到达增加静电作用的一条途径。对那些尺寸小于“空核”的反胶束中水体积的蛋白质，只要其所携带的净电荷与外表活性剂电性相反，萃取就能发生。蛋白质的相对分子质量Mr与(pH-pI)确定值呈线性关系,见图,这种关系，对阴离子及阳离子外表活性剂所形成的反胶束体系同样适用。,离子强度对萃取率的影响,离子强度对萃取率的影响主要是由离子对外表电荷的屏蔽作用所打算的：a.离子强度增大后，