cDNA末端快速扩增技术RACE

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,cDNA,末端快速扩增技术,(rapid amplification of,cDNA,ends,RACE),张晓玲,技术背景,基本,RACE,原理和方法,样品要求,RACE,产物的鉴定和全长,cDNA,的获得,基本,RACE,原理,技 术 背 景,得到某基因的片段、全长或近全长,cDNA,的方法：,建立和筛选,cDNA,和,DNA,文库。,利用,GenBank,数据库中的表达序列标签,(express sequence tags,ESTs,),拼接出全长或近全长,cDNA,。,是多聚酶链式反应即,PCR,。,cDNA,末端快速扩增,(RACE),技术,。,用,RNase,保护、,S1,核酸酶谱和引物延,伸等方法来保证,mRMA,5,末端的获取，但又需要大量的,mRNA,。,基本,RACE,原理和方法,利用,Oligo,(,dT,),对,mRNA,进行反转录的同时在两头加上通用接头,(,引物,),，,从而可利用基因特异的引物,(gene specific primer,，,GSP),通过,PCR,反应快速获得,目的序列的,5,端和,3,端。,RACE,流程,5-RACE,法原理图,（,1,）,（,2,）,（,3,）,（,4,）,RNase,H,样品要求：,提取,Total RNA,的材料要新鲜，采样后立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂。,Total RNA,无降解，,OD260/280=1.8 2.0,。,提供尽量多的实验材料：,3 RACE Total RNA,15,g,；,5RACE Total RNA,25,g,。如果基因的含量较低或者未知序列较长，样品量需相应增加。,RACE,产物的鉴定和全长,cDNA,的获得,3,或,5,双链,cDNA,限制性内切酶酶切,Southern blot,分析,克隆,3,和,5,重叠序列的连接,RACE,产物的,3,和,5,末端序列的分析,合成相应引物,PCR,获得全长,cDNA,SMART RACE,cDNA,synthesis Kit,SMART RACE,cDNA,synthesis Kit,碱基互补,配对原则,AT,之间,形成两个氢键,GC,之间,形成三个氢键,poly(C,),替代,poly(A,),增加,5,接头与,cDNA,第一链的结合牢固性,增加模板中有效双链丰度,提高目的基因获取几率,SMART RACE,cDNA,synthesis Kit,原理,cDNA,第一链的合成机制,SMART,er,RACE,流程,5 RACE,流程图,3 RACE,流程图,GSP,与,cDNA,模板的关系,GSP,要求：,23,28,nt,50,70%GC,Tm 65,；降落式（,touchdown,）,PCR,，,Tm 70,与通用引物的,3,-,末端不互补,GSP,与,cDNA,模板的关系,GSP1,：,5-RACE PCR,的反义引物,GSP2,：,3-RACE PCR,的正义引物,合适的酶切位点,100,200bp,注意：,GSP1,与,GSP2,的,Tm,值要相似,GSP,与,cDNA,模板的关系,NGSP,：,槽式（,Nested,）,PCR,引物,扩增后的预期：,具体实验方法,cDNA,第一链的合成,阳性对照,RACE PCR,实验,cDNA,末端的快速扩增,RACE,产物鉴定,试剂盒试剂,比较用,GSPs,和,NGSPs,引物获得的,PCR,产物,Southern blot analysis,Nucleo,Trap Gel,Exraction,克隆和测序,RACE,产物,