血清CK及其同工酶测定课件

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,血清,CK,及其同工酶测定,检验系生化,血清CK及其同工酶测定检验系生化,1,一、概述,肌酸激酶（,Creatine kinase，CK，EC2.7.3.2）,全称腺苷三磷酸：肌酸,N-,磷酸转移酶，催化肌酸（,Cr）,和,ATP,或磷酸肌酸（,CrP）,和,ADP,之间磷酸转移的可逆反应。,肌酸+,ATP,磷酸肌酸+,ADP+H,+,CK,一、概述肌酸激酶（Creatine kinase，CK，EC,2,偏碱,pH,有利于顺向反应进行，中性,pH,倾向逆向反应，一般逆向反应较顺向反应快26倍；,Mg,2+,是,CK,的必需激活剂，但过量反而抑制；,样品宜用血清或肝素化血浆；,标本应避免严重溶血；,血清中,CK,较不稳定，室温4,h,或412,h,可使酶失活。,偏碱pH有利于顺向反应进行，中性pH倾向逆向反应，一般逆向反,3,二、,CK,测定方法,比色法,紫外分光光度法,荧光法,二、CK测定方法比色法,4,比色法,利用顺向反应,1、测磷法,CrP,在酸液中易水解成,Cr,及无机磷酸。（,ATP,与,ADP,在酸性条件下较稳定）,比色法利用顺向反应,5,2、,酶偶联-丙酮酸测定法,肌酸+,ATP,磷酸肌酸+,ADP,ADP+,磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸+,ATP,丙酮酸+2，4-二硝基苯肼 丙酮酸-2，4-二硝,基苯腙,CK,丙酮酸激酶,2、酶偶联-丙酮酸测定法CK丙酮酸激酶,6,顺向反应测定,CK,的底物较便宜；,测磷法的试剂较易得而稳定；,丙酮酸激酶价格较贵，不易获得；,顺向反应速度较慢，灵敏度较低,。,顺向反应测定CK的底物较便宜；测磷法的试剂较易得而稳定,7,利用逆向反应,CrP+ADP Cr+ATP,Cr+,双乙酰+,-,萘酚,红色化合物,Mg,2+,作激活剂；,半胱氨酸供给巯基；,氢氧化钡和硫酸锌沉淀蛋白并终止反应。,CK,利用逆向反应CK,8,逆向反应,的速度较快，敏感性较高，成为目前,国内推荐,的主要方法。,必须用,中性或偏碱,的,蛋白沉淀剂,以防止底物,CrP,在酸性蛋白沉淀剂中非酶性水解成,Cr。,逆向反应的速度较快，敏感性较高，成为目前国内推荐的主要方法。,9,紫外分光光度法,多利用逆向反应，是国际最常用方法,CrP+ADP Cr+ATP,ATP+Glu ADP+6-P-Glu,6-P-Glu+NADP,+,6-P-GA+NADPH+H,+,CK,己糖激酶,G-6-PD,紫外分光光度法多利用逆向反应，是国际最常用方法CK己糖激酶G,10,全部反应最适,pH,为6.86.9；,主要干扰因素,谷光甘肽还原酶,腺苷酸激酶,全部反应最适pH为6.86.9；,11,荧光法,利用逆向反应生成的,Cr,在强碱性溶液中与茚三酮反应产生荧光复合物，测其荧光强度，经与同样处理的,Cr,标准管比较，可计算,CK,活力。,优点：快速、敏感，巯基化合物不产生干,扰，试剂易得，操作条件易于掌握。,缺点：需精密荧光分光光度计，不适宜基,层单位使用。,荧光法利用逆向反应生成的Cr在强碱性溶液中与茚三酮反应产生荧,12,酶偶联-丙酮酸测定法步骤（顺向反应）,空白,标准,测定,H,2,O,0.1,血清,0.1,标准,0.1,酶试剂,0.5,0.5,0.5,37，10,min,DNP,0.5,0.5,0.5,37，15,min,0.4,N NaOH,4,4,4,室温5,min，440nm,比色,酶偶联-丙酮酸测定法步骤（顺向反应）空白标准测定H2O0.1,13,计算：,Au/As200U/L,计算：Au/As200U/L,14,三、血清,CK,同工酶测定,方法：琼脂糖凝胶电泳法。,三、血清CK同工酶测定方法：琼脂糖凝胶电泳法。,15,