秋C-免疫学检测技术的基本原理课件

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,L/O/G/O,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,秋C 免疫学检测技术的基本原理,秋C 免疫学检测技术的基本原理秋C 免疫学检测技术的基本原理 体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素,体内：抗原+抗体免疫反应,体外：抗原+抗体进行检测,检测抗原或抗体的体外实验(血清学实验）,凝集反应,沉淀反应,免疫标记技术,蛋白质芯片技术,免疫细胞功能的检测,秋C 免疫学检测技术的基本原理秋C 免疫学检测技术的基本原理,1,体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素,体内：抗原,+,抗体免疫反应,体外：抗原,+,抗体,进行检测,检测抗原或抗体的体外实验,(,血清学实验）,凝集反应,沉淀反应,免疫标记技术,蛋白质芯片技术,免疫细胞功能的检测,体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素,2,（一）抗原抗体反应的特点,1.,高度特异性,2.,表面化学基团之间的可逆结合（可逆性）,3.,适宜的抗原抗体浓度和比例,（,比例性）,4.,抗原抗体反应的两个阶段,抗原抗体特异性结合阶段,可见反应阶段,（一）抗原抗体反应的特点,3,抗原抗体反应,物质基础是,抗原表位,(,决定簇,),与,抗体,CDR,的互补结合,(,相互吻合，具有互补性,),。,抗原抗体反应物质基础是抗原表位(决定簇)与抗体CDR的互补结,4,抗原和抗体的结合是互补性的特异性结合。通过,非共价键,结合。,2.,表面化学基团之间的可逆结合（可逆性）,抗原和抗体的结合是互补性的特异性结合。通过非共价键结合。2.,5,Ab,Ag,Ab,Ag,特异性,结合力的表示方法,亲和力和亲合力,低亲合力,高亲合力,Ag-Ab,结合的力,亲和力,亲合力,低亲和力,高亲和力,AbAgAbAg特异性结合力的表示方法亲和力和亲合力低亲合力,6,秋C-免疫学检测技术的基本原理课件,7,1.,电解质,0.85%,氯化钠或各种缓冲液,2,.,温度,37,56,3,.,酸碱度,最适,pH,值在,6-8,之间,1.电解质 0.85%氯化钠或各种缓冲液,8,第二节 检测抗原或抗体的体外试验,第二节 检测抗原或抗体的体外试验,9,定义：颗粒性抗原,(,细菌、细胞等或表面包被抗原的颗粒,),与相应的抗体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团块现象。,一、凝集反应（,agglutination reactions),一、凝集反应（agglutination reactions,10,包括：,1.,直接凝集反应,(direct agglunitation reatctions),玻片法：,ABO,血型鉴定、细菌鉴定,试管法：抗体效价的判定,2.,间接凝集反应,(indirect agglunitation reactions),包括：,11,直接凝集反应,1:2,稀释待测血清,1:4 1:8 1:16,玻片法,试管法,ABO,血型鉴定或菌种鉴定,检测抗体的,滴度或效价,直接凝集反应 1:2稀释待测血清,12,将可溶性,Ag/Ab,先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应,Ab/Ag,进行反应产生凝集，叫做间接凝集反应。,间接凝集反应,将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗,13,二、沉淀反应（,precipitation reactions,）,定义：,可溶性抗原与相应抗体在适当电解质存在条件下结合，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。,二、沉淀反应（precipitation reactions,14,可在液体,/,半固体琼脂中进行。,包括：,1.,单向琼脂扩散（可溶性抗原定量）,2.,双向琼脂扩散,3.,免疫电泳,可在液体/半固体琼脂中进行。,15,Ag,Ag,Ag,Ag,Ab in gel,单向琼脂扩散,用于确定抗原浓度,AgAgAgAgAb in gel单向琼脂扩散用于确定抗原浓,16,Ag1,Ab,Ag2,Ag3,Ag4,双向免疫扩散,鉴定多种抗原是完全相同、部分相同或完全不同，抗原纯度鉴定,Ag1AbAg2Ag3Ag4双向免疫扩散鉴定多种抗原是完全相,17,免疫电泳,存在于不同区域的抗原与抗体结合，在比例适宜处形成沉淀弧。,沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对比，可分析样品的成分及其性质。,免疫电泳 存在于不同区域的抗原与抗体结合，在比,18,将抗原抗体反应与标记技术相结合，将已知的抗体或抗原标记上失踪物质，通过检测标记物，间接测定抗原,-,抗体复合物的一类试验方法。,三、免疫标记技术,(immunolabeling techniques),将抗原抗体反应与标记技术相结合，将已知,19,常用的标记物：,酶,荧光素,放射性元素,胶体金,化学发光物质等,常用的标记物：,20,免疫酶测定法,双抗体夹心法,ELISA,间接,ELISA,a,）,b,）,BASELISA,利用生物素和抗生物素蛋白为桥梁,免疫酶测定法双抗体夹心法ELISAa）b）BASELIS,21,d,）免疫组化技术,定位、定性、定量检测,d）免疫组化技术定位、定性、定量检测,22,免疫荧光技术,免疫荧光技术,23,秋C-免疫学检测技术的基本原理课件,24,放射免疫测定,用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将同位素的,敏感性,与抗原抗体结合的,特异性,结合起来，具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、药物等微量物质的检测。常用的有,131,I,、,125,I,。,化学发光免疫技术,将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。最常用的发光物质是,鲁米诺,。,灵敏度高、简便、可实现自动化分析。,放射免疫测定 用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。,25,免疫胶体金技术,用胶体金颗粒标记,Ab/Ag,，以检测未知,Ag/Ab,的方法。,氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态。,该技术可应用于,免疫组化,(,光镜下检查,),和,免疫层析,快速诊断。,免疫胶体金技术用胶体金颗粒标记Ab/Ag，以检测未知Ag/,26,免疫印迹法,-Western blotting,免疫印迹法-Western blotting,27,又称为蛋白质微阵列，指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微阵列。根据蛋白质分子间特异性结合的原理，可实现快速、准确、高通量的检测。,又称为蛋白质微阵列，指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微阵,28,第三节 免疫细胞功能的检测,淋巴细胞及其亚群的分离,免疫细胞,功能测定,磁珠分离法,免疫吸附分离法,流式细胞术,肽,-MHC,四聚体技术,T,细胞功能测定,B,细胞功能测定,细胞因子检测,T,细胞增殖试验,迟发型超敏反应的检测,抗体含量测定,溶血空斑试验,巨噬细胞吞噬试验,细胞毒试验,吞噬功能测定,51,Cr,释放法,乳酸脱氢酶释放法,细胞染色法,凋亡细胞检测法,硝基蓝四氮唑试验,生物活性检测法,免疫学检测法,第三节 免疫细胞功能的检测淋巴细胞及其亚群的分离免疫细胞磁珠,29,一、免疫细胞的分离,外周血单个核细胞的分离,稀释,血液,淋巴细胞分离液,(,葡聚糖,-,泛影葡胺,),离心,一、免疫细胞的分离外周血单个核细胞的分离稀释淋巴细胞分离液(,30,E,花环形成试验,E花环形成试验,31,磁珠分离法,免疫吸附分离法,流式细胞术,肽,MHC,四聚体技术,淋巴细胞及其亚群的分离,磁珠分离法免疫吸附分离法流式细胞术肽MHC四聚体技术淋巴细,32,免疫吸附分离法,加入淋巴,细胞悬液,anti-CD4,anti-CD4,anti-CD4,弃上清,免疫吸附分离法加入淋巴anti-CD4anti-CD4ant,33,磁珠分离法,磁珠分离法,34,流式细胞术,荧光抗体标记混合细胞,喷嘴,单细胞悬液,5000-10000,个,/,秒,细胞分选器,荧光,检测器,流式细胞术荧光抗体标记混合细胞喷嘴单细胞悬液细胞分选器荧光检,35,二、免疫细胞功能的测定,T,细胞功能测定,B,细胞功能测定,细胞因子检测,T,细胞增殖试验,迟发型超敏反应的检测,抗体含量测定,溶血空斑试验,巨噬细胞吞噬试验,细胞毒试验,吞噬功能测定,51,Cr,释放法,乳酸脱氢酶释放法,细胞染色法,凋亡细胞检测法,硝基蓝四氮唑试验,生物活性检测法,免疫学检测法,二、免疫细胞功能的测定T细胞功能测定B细胞功能测定细胞因子检,36,T,细胞功能测定,T,细胞增殖试验,迟发型超敏反应的检测,T,细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可通过以下三种方法检测：,形态计数法：,活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核松散及出现较多核仁；,3,H-TdR,或,125,I-UdR,掺入法：,3,H-TdR,能掺入到合成的,DNA,中，用液体闪烁仪检测样品的放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器，易有放射性污染。,MTT(,四甲基偶氮唑盐,),比色法：,外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试，可导致迟发型超敏反应，,T,细胞活化并释放多种细胞因子，产生以单个核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血渗出，,24-48h,发生，,72h,到达高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的发生水肿甚至坏死。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免疫低下者呈弱阳性或阴性反应。常用于检测某些微生物感染、免疫缺陷病、肿瘤患者免疫功能测定。,T细胞功能测定T细胞增殖试验迟发型超敏反应的检测T细胞受到特,37,B,细胞功能测定,抗体含量测定,溶血空斑试验,可通过单项琼脂扩散法、,ELISA,、速率比浊法等测定标本中各类,Ig,的含量。,绵羊红细胞,(SRBC),免疫动物,4,天后取出动物脾脏，在脾细胞悬液中含有抗,SRBC,的浆细胞,脾细胞与,SRBC,在适量琼脂糖液中混匀,在抗体形成细胞周围出现溶解的透明区，即溶血空斑。,1,个空斑区代表,1,个浆细胞,通过记录溶血空斑的数目可知抗原特异性,B,细胞的数目,加入新鲜补体，倒入平皿中培养,B细胞功能测定抗体含量测定溶血空斑试验可通过单项琼脂扩散法、,38,谢谢大家！,结 语,谢谢大家！结 语,39,