MRSA耐药机制及检测方法

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,MRSA,耐药机制及检测方法,府伟灵,第三军医大学附属西南医院检验科,overview,MRSA，methicillin resistant Staphylococcus aureus耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,1961年在英国由Jevons,首次发现，是引起医院,感染的重要病原菌之一,overview,MRSA是携带mecA基因、编码低亲和力青霉素结合蛋白，导致耐甲氧西林、所有头孢菌素、碳青霉烯类、青霉素类+青霉素抑制剂抗生素的葡萄球菌,感染多发于免疫缺陷患者、老弱患者及手术、烧伤后患者，极易导致感染爆发流行、治疗困难，病死率高,overview,不均一耐药性,MRSA菌落内存在敏感和耐药两个亚群，即一株MRSA中只有一小局部细菌约104107，对甲氧西林高度耐药，在50 g/ml甲氧西林条件下尚能生存，而菌落中大多数细菌对甲氧西林敏感，在使用抗生素后的几小时内大量敏感菌被杀死，但少数耐药菌株却缓慢生长，在数小时反又迅速增殖。,overview,广谱耐药性,MRSA,除对甲氧西林耐药外，对其它所有与甲氧西林相同结构的,-,内酰胺类和头孢类抗生素均耐药，,MRSA,还可通过改变抗生素作用靶位，产生修饰酶，降低膜通透性产生大量,PABA,等不同机制，对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类、利福平均产生不同程度的耐药，唯对万古霉素敏感。,overview,生长特殊性,MRSA,生长缓慢，在,30C,，培养基,pH 7.0,及高渗,(40 g/L NaCl,溶液,),条件下生长较快。在,30C,时，不均一耐药株表现为均一耐药和高度耐药，在,37C,又恢复不均一耐药。均一耐药株在,37C,或,pH,5.2,时，均一耐药性可被抑制而表现为敏感。增加,NaCl,浓度，低温孵育和延长时间，可使不均一耐药株群体中敏感亚群中的耐药性得到充分表达，即能耐受较高浓度的甲氧西林，而对其中耐药亚群无影响。,但最近也有报道，高渗下延长培养时间，会影响,MRSA,的检出结果。因为在高盐情况下，培养,48 h,，对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌,(methicillin sensitive Staphylococcus aureus,，,MSSA),易产生大量,-,内酰胺酶，可缓慢水解甲氧西林，导致细菌生长，而误认为,MRSA,。所以一般,MRSA,在高盐环境孵育,24 h,，而耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌,(MRCNS),由于耐药亚群菌数少于金葡菌，应孵育,48,小时观察结果。,overview,鉴于该菌对目前临床上所使用的抗生素大多数有很高的耐药率和多重耐药性,除对甲氧西林耐药外,对绝大多数,-,内酰胺类抗生素呈交叉耐药,并可对氨基糖甙类、大环内酯类等常用抗生素产生多重耐药，极易引起感染的爆发流行，给临床治疗带来极大的困难，因而成为世界关注的难题,Epidemic status,全球：,1993年，日本Kansai 医大附院MRSA 别离率为41%,1999年，英国30 个监测中心MRSA 检出率最高为56.7%,1999年，根据美国疾病控制中心(CDC)统计，全美重症监护病房MRSA感染率为52.3%,Epidemic status,中国：,自70年代发现有MRSA以来，近几年MRSA的,检出率正在逐年上升,1989 年，上海地区MRSA 的别离率为60%，,1996年激增至72%,1999-2001年，重庆地区 MRSA 别离率为65.1%,Resistance mechanism,PBPs,青霉素结合蛋白 penicillin binding proteins,PBPs)，由金黄色葡萄球菌自身合成,普通的金黄色葡萄球菌合成五种与内酰胺类抗生素亲和力较高的PBPs，包括PBP1、PBP2、PBP3、PBP3和PBP4,Resistance mechanism,PBPs参与细菌细胞壁合成的转肽酶、羧肽酶和内肽酶,催化糖肽交叉联接反响，对细菌的生长繁殖起着极其重要的作用,-内酰胺类抗生素与PBPs共价结合后，PBPs失去活性而阻断细胞壁的合成,导致细菌死亡,Resistance mechanism,MRSA染色体中含有mecA基因，另外合成一种分子量为78kD的与-内酰胺类抗生素亲和力较低的青霉素结合蛋白，因其电泳率介于PBP2与PBP3之间，故称为PBP2a或PBP2,PBP2a 蛋白属高分子量PBP78kD,具有与高亲和力PBPs 相同的青霉素结合基序，而结合能力却很低，当MRSA中高亲和力PBPs结合-内酰胺类抗生素失活后，PBP2a可代替PBPs，维持细菌的生长和存活，从而使MRSA表现出耐药性,mecA,基因,mec即甲氧西林耐药决定因子，是整合到葡萄球菌上的3050kb的外来插入片段，其中mecA基因是PBP2a的编码基因，是MRSA的主要耐药基因,mecA基因存在于MRSA和局部凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase negative staphylococci,CNS or CoNS)中，mec片段末端存在末端反向重复序列，且均插入到环状染色体的SmaIG部位编码A蛋白的spa基因和腺嘌呤生物合成必须的purA基因之间，具有位置特异性,mecA,基因,mecDNA片段52kb是可移动的遗传元件，命名为葡萄球菌染色体mec盒staphylococcal chromosomal cassette mec，SCCmec，包括mec及ccr基因复合体,SCCmec可以以多种的插入方式插入到其它的染色体和质粒中，使耐药性进行水平性的转移或者在不同家系的葡萄球菌间传播,影响,mecA,表达的因素,mecA基因的根本调节基因为mecI和mecR1,mecI基因编码mecI蛋白为抑制因子，当其结合到mecA基因的启动子上时，抑制mecA基因地转录，从而不能产生PBP2a,mecR1基因编码mecR1蛋白为诱导因子，当其接触到诱导剂-内酰胺类抗生素时被活化，活化的mecR1蛋白能够去除mecI蛋白对mecA基因地阻遏作用，使mecA编码产生PBP2a蛋白,影响,mecA,表达的因素,mecA,基因的,5,端的核苷酸序列与编码,-,内酰胺酶的,blaZ,基因具有同源性，,mecA,基因的表达也受到,-,内酰胺酶诱导基因,blaI,和,bla R1,的共同调节，但相对于,mecI,和,mecR1,基因作用较弱,影响,mecA,表达的因素,温度、pH值、盐离子浓度对mecA基因的表达亦有影响,研究说明，温度3035，pH值7.07.2，盐浓度4时mecA基因表达最强，PBP2a产量最多MIC最高,其他耐药相关基因,携带mecA基因的MRSA耐药性有很大的差异MIC为162000mg/L,将转座子Tn551插入到高度耐药的MRSA菌株染色体中，其PBP2a的表达量没有变化，而对-内酰胺类抗生素的敏感性显著提高,说明存在除mec基因之外地其它耐药相关基因,其他耐药相关基因,fem基因,fem因子factors essential for meticillin resistance，是金黄色葡萄球菌染色体中的固有基因，包括femA、femB、femC、femD、femE、femF。,hmrC、hmrD和chr基因,是染色体突变基因，引起MRSA对甲氧西林的高度耐药，其机制尚未说明,fem,基因,1,femA,和,femB,为两个相连的开放阅读框，对细菌细胞壁的五甘氨酸侧链以及肽间桥的生物合成是必需的。当其失活时，,MRSA,对,-,内酰胺酶类抗生素以及多种其它类抗生素的耐药性降低,2,femC,的作用引起谷氨酰胺合成酶基因,glnA,转录和活化及异谷氨酰胺的酰胺化，其失活时，糖肽的交叉连接降低，,MRSA,对,-,内酰胺酶类抗生素耐药性降低,2,femF,基因的编码产物涉及,L-,赖氨酸与胞壁酰二肽链的连接，其突变失活时引起的耐药性的改变得具体机制还有待研究。,femD,和,femE,对细菌的确切作用还未阐明,Detection for MRSA,MALDI-TOF MS,细菌指纹图谱法,传统方法,药物敏感试验方法,NCCLS,推荐使用药敏纸片法、苯唑西林,(oxacillin),盐琼脂筛查法、,-,内酰胺酶检测、,E-test,试验和试管双倍稀释法等,缺点,：易受培养基成分影响，较耗时，且错误应用抗生素会引起更为严重耐药的耐药菌株的出现,快速乳胶,(Latex),凝集法,PBP2a,单克隆抗体致敏的乳胶颗粒与,MRSA,的膜蛋白提取物作用,产生肉眼可见的凝集颗粒,证实有,PBP2a,的存在,以此判断该菌为,MRSA,此法简便、快速、准确,检测,1,份标本只需,15 min,，和,PCR,法一样有极高的灵敏度和特异性，有较好的应用前景,免疫学方法,基质辅助激光解吸电离,-,飞行时间质谱,可简易分析低纯度的固体混合物样品,检测范围可到,350 KD,。根据细菌的全细胞图谱差异，鉴定未知细菌。耗时少，重复性高,缺点：要求特殊仪器，结果处理方法复杂，不适于普遍开展,分子生物学方法,分型方法,传统方法是噬菌体分型技术,根据别离菌株对各噬菌体的敏感性和噬菌体裂解情况进行分型。目前采用的一些分子生物学进行基因分型的方法有：脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)、逆向凝胶电泳(field inversion gelelectrophoresis,FIGE)、随机扩增多态性DNArandom amplified polymorphic DNA，RAPD、多位点序列分型multilocus sequencing typing，MLST等,PCR,法,mecA,基因高度保守,根据其核苷酸序列设计不同的引物,用,PCR,对菌株中,PBP2a,靶,DNA,特定片段,mecA,进行扩增,以,mecA,基因存在与否判定是否为,MRSA,菌株，不受药敏实验条件的影响,因而特异性高,被公认为是其诊断的,金标准。,mecA,和,femB,基因表达均为阳性,方能确诊为,MRSA,MRSA,的治疗和预防,MRSA,的治疗,万古霉素是目前临床上治疗,MRSA,唯一疗效肯定的抗生素,NCCLS,规定：万古霉素敏感,4 g/ml,，中介,8,16 g/ml,，耐药,32 g/ml,，,MRSA,的治疗和预防,万古霉素一种三环糖肽类抗菌药物，它和细菌中的另一种分子细胞壁肽聚糖前体五肽结合而抑制细菌细胞壁蛋白合成，和破坏细胞膜及阻碍细菌RNA合成的多种作用，因此使用万古霉素仍然可以杀死MRSA。但是滥用万古霉素那么会产生别的抗药病菌，最常见的是耐万古霉素肠球菌,MRSA,的治疗和预防,随着万古霉素的广泛使用，也许不久也会出现耐万古霉素的,MRSA,，因此现在就必须适量地慎用万古霉素,除万古霉素外，还有壁霉素、香豆霉素等新药对,MRSA,有较强的抗菌活性。另外，万古霉素也可与磷霉素、利福平、氨基糖苷类、喹诺酮类药物合用，加强治疗效果,MRSA,的治疗和预防,自2002年美国报道了第1株耐万古霉素的金黄色葡萄球菌以来,先后出现3株VRSA。我国尚无耐万古霉素金葡菌的报道，如万古霉素对MRSA治疗无效,后果将不堪设想,细菌的抗药性是不可防止的，但并不是不可以控制的，导致超级病菌流行的重要原因是滥用抗菌药物。,MRSA,的治疗和预防,目前临床滥用抗生素的现象，对,MRSA,的流行起了一定的扩散作用，第三代头孢菌素的长期使用与,MRSA,的出现率呈平行关系,医护人员检查病人前后要严格洗手消毒，有条件应用一次性口罩、帽子、手套，医疗用品要固定，以防院内交叉感染,合理使用抗生素,早期检出带菌者,加强消毒制度,医院应加强对新入院及,MRSA,易感者的检查，尤其是烧伤病区、,ICU,、呼吸病房、血液科和小儿科等。同时细