土壤中分解尿素的细菌的分离与计数定稿课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,课题,2,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,1,、尿素的利用,尿素,是一种重要的,农业氮肥。,尿素,不能直接,被农作物,吸收。,土壤中的细菌将尿素,分解成氨,之后才能被植物利用。,2,、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们,能合成脲酶,CO(NH,2,),脲酶,+CO,2,NH,3,+H,2,O,4,、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样,的细菌,一,.,研究思路,.,筛选菌株,.,统计菌落数目,.,设置对照,1,、实例：,启示：,寻找目的菌种时要根据它对生存环境的,要求，到相应的环境中去寻找。,原因：因为热泉温度,70,80,0,C,，,淘汰了绝大多,数微生物只有,Taq,细菌被筛选出来。,DNA,多聚酶链式反应,是一种在体外将,少量,DNA,大量复制,的技术，此项技术要求使用,耐高温（,93,0,C,）的,DNA,聚合酶。,.,筛选菌株,2,、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供,有利于目的菌株生长,的条件,(,包括营养、温度、,pH,等,),，同时,抑制或阻止其他微生物,生长。,什么是选择性培养基？,15.0g,琼脂,1.0g,尿素,10.0g,葡萄糖,0.2g,MgSO,4,7H,2,O,2.1g,NaH,2,PO,4,1.4g,KH,2,PO,4,3,、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：,葡萄糖、尿素,氮源：,尿素,培养基的,氮源为尿素,，只有能合成,脲酶,的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。,缺乏,脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,5,、培养基选择分解尿素的微生物的原理,6,、怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为,唯一氮源,的培养基,牛肉膏,蛋白胨,培养基,是,分离,尿素,细菌,判断该,培养基,有无选,择性,实验组,对照组,培养基类型,是否,接种,目的,结果,只生长尿素细菌,生长多种微生物,是,6,、怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为,唯一氮源,的培养基,牛肉膏,蛋白胨,培养基,是,分离,尿素,细菌,判断该,培养基,有无选,择性,实验组,对照组,培养基类型,是否,接种,目的,结果,只生长尿素细菌,生长多种微生物,是,1,、显微镜直接计数：,利用,血球计数板,，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.,统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌；,不适于对运动细菌的计数；,需要相对高的细菌浓度；,个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,2.,间接计数法（,活,菌计,数法）,原理：,在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的,一个菌落,是由,一个单细胞,繁殖而成的，即,一个菌落代表原先的一个单细,胞。,常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数,(C,V),M,其中，,C,代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，,V,代表涂布平板时所用的稀释液的体积,(ml),，,M,代表稀释倍数。,注意事项,为了保证结果准确，一般选择菌落数在,30,300,的平板上进行计数。,为使结果接近真实值可将同一稀释度加到,三个或三个以上,的平皿中，经涂布，培养计算出菌落,平均数,。,统计的菌落往往比活菌的,实际数目,低,。,设,置对照的主要目的是排除实验组中,非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,.,设置对照：,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌,落数目的实验时，,A,同学从对应的,10,6,倍稀释的培养基中筛选出大约,150,个菌,落，但是其他同学在同样的稀释度下,只选择出大约,50,个菌落。分析其原因。,原因：土样不同，,培养基污染或操作失误,(,或者是混入了其他的含氮物质,),小结：,通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：,由其他同学用与,A,同学相同土样进行实验,方案二：,将,A,同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：,如果结果与,A,同学一致，则证明,A,无误；如果结果不同，则证明,A,同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,二,.,实验的具体操作,.,土壤取样,从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土,3cm,左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。,.,制备培养基：,制备以尿素为唯一氮源的,选择培养基,。,应在火焰旁称取土壤,10g,。,在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁,进行,三,样品的稀释,.,取样涂布,实验时要对,培养皿作好标记,。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,.,取样涂布,分离不同的微生物采用不同的稀,释度,稀释倍数,目的,细菌,10,4,、,10,5,、,10,6,保证获得菌落数在,30,300,之间、适于计数的平板,放线菌,10,3,、,10,4,、,10,5,真菌,10,2,、,10,3,、,10,4,原因：不同微生物在土壤中含量不同,.,微生物的培养与观察,在,菌落计数时，每隔,24h,统计一次菌落数,目。,选,取菌落数目稳定时的记录作为结果，,以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培,养不同微生物往往需要不同培养温,度。,细菌：,30,37,培养,1,2d,放线菌：,25,28,培养,5,7d,霉菌：,25,28,的温度下培养,3,4d,。,如果得到了,2,个或,2,个以上,菌落数目在,30,300,的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果,同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确,，需要重新实验。,微生物的培养与观察,三,.,结果分析与评价,1.,通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。,2.,提示：选择每个平板上长,有,30,300,个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合,适。同,一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。,四、操作提示,无菌操作,做好标记,规划时间,五,.,课外延伸,在,以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果,PH,升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素,。,测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌,菌落呈现黑色,，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。,大肠杆菌呈 黑色中心,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊,红美蓝琼脂,(EMB),上典型特征,本课题知识小结,:,六、例题解析,例,1,对细菌群体生长规律测定正确的表述是,A,在液体培养基上进行,B,至少接种一种细菌,C,接种一个细菌,D,及时补充消耗的营养物质,解析：细菌群体,生长规律的测定,是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一,种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数,。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。,答案：,A,1.,对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）,A.,在液体培养基上进行,B.,至少接种一种细菌,C.,接种一个细菌,D.,及时补充消耗的营养物质,2.,使用选择培养基的目的是（）,A.,培养细菌,B.,培养真菌,C.,使需要的微生物大量繁殖,D.,表现某微生物的特定性,状与,其他微生物加以区别,3.,能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是,(),A.CO,2,和,N,2,B.,葡萄糖和,NH,3,C.CO,2,和尿素,D.,葡萄糖和尿素,实践训练,A,C,D,4.,下列说法不正确的是（）,A.,科学家从,70,80,度热泉中分离到耐高温的,TaqDNA,聚合酶,B.,统计某一稀释度的,5,个平板的菌落数依次为,M1,、,M2,、,M3,、,M4,、,M5,，以,M3,作为该样品菌落数的估计值,C.,设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度,D.,同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。,5.,为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）,A.,较多的氮源物质,B.,较多的碳源物质,C.,青霉素类药物,D.,高浓度食盐,B,C,练一练,用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比（）,A.,比实际值高,B.,比实际值低,C.,和实际值一致,D.,比实际值可能高也可能低,下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是,(),A.KH2PO4,、,NA2HPO4,、,MgSO4.7H2O,、葡萄糖、尿素、琼脂、水,B.KH2PO4,、,NA2HPO4,、,MgSO4.7H2O,、葡萄糖、琼脂、水,C.KH2PO4,、,NA2HPO4,、,MgSO4.7H2O,、尿素、琼脂、水,D.KH2PO4,、,NA2HPO4,、,MgSO4.7H2O,、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水,1,下课了,