Hedgehog信号转导通路下游转录因子Gli1在人神经胶质瘤中对水通道蛋白AQP1调控作用的研究【大学毕业论文】

Hedgehog信号转导通路下游转录因子Gli1在人神经胶质瘤中对水通道蛋白AQP1调控作用的研究第二军医大学博士学位论文Hedgehog号转导通路下游转录因子Gli1在人神经胶质瘤中对水通道蛋白AQP倜控作用的研究姓名杨朝旭申请学位级别博士专业生物化学与分子生物学指导教师王红阳20090501在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究第一部分摘要信号转导通路下游转录因子在人神经胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究研究背景和目的信号转导通路是在脊椎动物的中枢神经系统发育中起至关重要作用的一条信号通路其在胚胎早期可以通过通路各组分不同时间空间特异性表达对多种细胞的命运决定产生影响并且可以与等信号通路产生相互作用来实现不同细胞定向分化的精细调节信号的调节紊乱在胚胎期会造成神经系统的发育障碍和畸形在已经成熟的个体则会导致月中瘤的发生最初是在研究神经胶质瘤时发现并命名的一个基因其编码的蛋白是信号途径最重要的下游转录因子之一也是信号最终的响应者和功能的执行者信号通路在神经胶质瘤中处于一种调节紊乱的异常激活状态在胶质瘤的发生发展中起着重要作用其上游配体信号的存在对于胶质瘤的生长及月中瘤干细胞的自我更新能力的维持有着重要作用其下游转录因子可以通过调节的表达水平参与胶质瘤细胞的增殖和凋亡同时也与胶质瘤的恶性程度和恶性生物学行为的维持密切相关水通道蛋白是类分布在细胞膜表面能够特异的对水分子进行快速高效跨膜转运的小分子通道蛋白家族在中枢神经系统中主要分布的水通道蛋白是近年来的研究发现与神经系统的一些疾病尤其是月中瘤性疾病的进展有着密切的关系在胶质瘤细胞向周围组织的侵袭生长及瘤周组织的脑水月中形成方面都发挥了重要的作用虽然已经有大量的研究阐明了是如何通过自身的通道结构对水分子进行跨膜转运的但是对其本身表达水平的高低受何种机制的调控尤其是它与主要信号通路之间的关系仍然知之甚少第二军医大学博士学位论文本研究拟从一种中枢神经系统最常见的月中瘤神经胶质瘤入手研究通路的异常激活与水通道蛋白之间的关系旨在证明通路下游转录因子对的表达具有调控作用阐明这种调控是在何种水平以何种方式进行并对这种调控作用对神经胶质瘤细胞恶性生物学行为产生的影响进行了初步探讨实验方法用免疫组织化学免疫荧光共定位实验和等方法研究神经胶质瘤标本中通路的激活情况以及的表达情况并对两者之间的相关程度进行分析构建包含启动子区全长的报告基因质粒一将与报告质粒共转细胞荧光素酶报告基因系统检测对激活程度的影响将过表达质粒瞬转细胞收获不同时间点及不同转入剂量的样品观察转录水平观察蛋白水平的表达变化设计合成基因特异的干扰片段构建干扰载体体外验证有效后研究干扰掉后对报告基因活性及胶质瘤细胞系中表达的影响建立分别稳定转染空载体过表达及稳定干扰的三种神经胶质瘤细胞系一方法检测三种细胞系中表达水平的变化将报告质粒转入三种不同的稳定细胞系中检测转录活性的变化分析启动子区根据的核心结合序列设计引物运用染色质免疫共沉淀技术研究与启动子区的结合情况根据实验结果利用重叠延伸技术构建启动子区突变报告基因质粒转入相应的稳定细胞系中利用报告基因检测确定在对调控中起关键作用的启动子区段位置阐明调控作用的机带在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究利用和实验比较不同细胞系侵袭能力的差异评价在胶质瘤细胞系中调控表达所引起的生物学功能变化实验结果神经胶质瘤组织标本中和的表达与对照正常组织相比都呈现出异常高表达的状态并且两者之间的高表达具有特异的相关性外源瞬时转入及稳定表达都可以在转录和翻译水平上调的表达并能显著增强含有启动子区全长的报告基因的活性特异性干扰的表达则可以降低的表达并抑制的报告基因活性可以和启动子区中的保守调节序列相结合其中启动子区位的保守结合序列对维持的调节作用至关重要表达水平不同的神经胶质瘤细胞系表现出不同的侵袭转移能力在侵袭能力较低的细胞系中外源性转入可以使其侵袭能力得到恢复提高提示神经胶质瘤中可能通过上调的表达来增强月中瘤细胞的恶性生物学特性结论本研究首次发现了神经胶质瘤中通路异常活化与异常高表达两种现象之间的关系并且证实通路下游转录因子可以通过与启动子区的结合在转录和翻译水平对其表达进行调控其中启动子区段的序列在这一调控作用中发挥重要作用在胶质瘤细胞中这一调控作用的生物学意义是可以通过上调来增强胶质瘤细胞的恶性侵袭能力关键词信号通路神经胶质瘤转录调节在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究第二部分摘要基于结构修饰的靶向通路小分子抑制剂的筛选研究研究背景和目的信号转导通路通路是一条高度保守的在生物的胚胎发育及多种疾病的发生发展过程中起重要作用的信号通路近年来的研究表明在种人类恶性月中瘤性疾病中如脑胶质细胞瘤基底细胞癌胰腺癌非小细胞肺癌前列腺癌等该通路都呈现出异常的活化状念并且对月中瘤的发生及发生后 月中瘤组织的生长和恶性生物学特性的维持起着重要作用人们在研究通路与 月中瘤之间关系时发现特异性抑制通路可以抑制多种肿瘤细胞的增殖以及向 其他器管侵袭转移的能力因此信号通路被认为是一条比较理想的可以作为月中瘤靶向治疗的信号途径针对通路的小分子抑制剂的开发及研究 工作方兴未艾逐渐成为国际研究的热点介芬胺是从藜产属植物中提取的一种小分子天然产物在化学结构上属于一种箔体类生物碱可以与通路上游激活因子特异性结合而抑制该通路信号的传递进而发挥抑制月中瘤细胞的增殖的效应是一种有潜在临床应用价值的小分子抑制剂但是作为一种天然产物其抑制通路活性的作用并不是很强且具有较大的化学毒性这一缺陷限制和延缓了 其作为一种新型抗肿瘤药物的研发与应用本研究拟以为先导化合物通过结构修饰和改造的方法制备系列目标衍生物然后对制备的衍生物进行抑制通路的特异性筛选及抗月中瘤活性筛 选并与已有的通路抑制剂的活性进行比较最终期望获得两个高效低毒高特异性的通路抑制剂并对结构修饰规律作出总结为新型抗月中瘤药物的研发提供基础第二军医大学博士学位论文实验方法结构修饰衍生物的获得以为底物分别经醴化烧化酰化甲基化氯代等特异性化学修饰得到一系列衍生化合物衍生物高通量筛选平台的构建在通路组成性激活的细胞系中稳定转染可以反应通路激活程度的报告基因将该细胞系命名为并对该细胞系反映通路激活程度的敏感性进行鉴定初次筛选以步骤中构建的稳定细胞系为筛选工具将步骤中得到的衍生物以浓度作用于体外培养的后测定报告基因数值观察各化合物对通路的抑制效应得到可以相对特异性抑制通路活性的化合物二次筛选细胞活性检测再次筛选步骤中得到的化合物对体外培养的的细胞毒性排除初筛过程中报告基因数值的降低是由于化合物本身的毒性导致细胞死亡所致得到对细胞增殖抑制不明显但可以显著抑制报告基因活性的毒性低特异性好的衍生物及检测步骤中得到的化合物对细胞中通路下游转录因子表达的抑制作用进一步验证化合物的特异性法检测经二次筛选得到的衍生物在体外对月中瘤细胞的增殖抑制作用裸鼠荷瘤实验将得到的化合物以不同剂量灌胃给药观察其对体内月中瘤的生长抑制作用最终得到具有较高的抗月中瘤活性低毒高效的通路抑制剂实验结果以为先导化合物进行化学修饰和改造分离纯化后共得到个衍生物报告基因法初筛检测修饰后的化合物对通路的相对抑制作用与阳性对照药物环杷明相比较共有个化合物显示出与其类似或更佳的抑制作用用法再次检测初筛得到的化合物对体外培养细胞的增殖活性的影响剔除细胞毒性较大的衍生物再次筛选后得到个毒性较低特异性较好的化合物分别为号化合物号化合物在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究号化合物号化合物及结果显示经两次筛选后得到的个化合物可以有效降低通路下游转录因子的及蛋白表达水平提示其具有良好的特异性抑制通路活性的作用在体外月中瘤细胞增殖抑制实验中筛选到的化合物显示出选择性抑制通路依赖的月中瘤细胞的特性裸鼠荷瘤实验中四种化合物均表现出较好的抑制月中瘤生长的作用其对体内月中瘤生长的抑制效率如下号化合物为号化合物为号化合物为号化合物为其中统计学分析结果表明号化合物对月中瘤生长的抑制作用要优于阳性对照化合物环杷明结论本研究以为先导化合物首先经特异性结构修饰改造得到一系列衍生物然后对衍生物在抑制通路的特异性体内外毒性抗肿瘤活性等方面的特性进行连续筛选最终得到四个特异性较好毒性较低抗月中瘤活性较强的阳性化合物其中有三个化合物在上述特性上与阳性对环杷明类似一个化合物要优于坏杷明对所得阳性化合物的结构改造位点与先导化合的结构进行比较分析可以得出以下规律氧化能够增强化合物的特异性及抗月中瘤活性但不明显对化合物毒性影响亦不显著化合物的毒性针对通路的特异性以及抗月中瘤活性主要与与结构中哌噬环的密切相关对哌噬环的进行结构修饰是发现高效低毒衍生物的重要方向结构修饰关键词介芬胺通路小分子抑制剂第二军医大学博士学位论文第二军医大学博士学位论文一英文缩略词表英文全称中文全称缩写牛血清白蛋白染色质免疫沉淀环杷明焦碳酸二乙酯改培养基二甲基亚碉 乙二胺四乙酸胎牛血清多形性胶质母细胞瘤绿色荧光蛋白免疫组化聚合酶链反应干扰逆转录聚合酶链反应独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意本人承担本声明的法律责任吼学位论文作者签名才询她钙月白学位论文版权使用授权声明本人完全了解第二军医大学有关保留使用学位论文的规定第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版允许论文被查阅和借阅本人授权第二军医大学可以将学位论文全文或部分内容编入中国学位论文全文数据库 中国优秀博硕士学位论文全文数据库等数据库进行检索可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存汇编学位论文保密的学位论文在解密后适用本授权书导师签名学位论文作者虢锄拙喀碧，日期年曩月 日 魄叼年乡月日 在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究 第一部分通路下游转录因子在人神经胶质瘤中对水 通道蛋白调控作用的研究神经系统是人体最精细结构和功能最复杂的系统由数以亿万计的高度相 互联系的神经细胞组成由于神经系统发育不良及后天的病变导致的各种神经性 疾病尤其是月中瘤性病变已经成为危害人类的主要疾病之一胶质细胞瘤 也称神经胶质细胞瘤起源于神经外胚叶组织是中枢神经系统最为常见的原性月中瘤在人类对抗和干预胶质细胞瘤的历史中虽然已形成了一整套以手术中心辅以放疗和化疗等多种措施的综合治疗方案但是由于胶质细胞瘤生长 迅速无边界浸润易于复发等特性其治疗预后仍不尽理想据统计胶质细 胞瘤在神经上皮组织月中瘤中约占约占颅内月中瘤的而神经胶质 细胞瘤患者的平均生存期仍少于年因此加强胶质细胞瘤致病机理及发生 发展的基础科学研究为临床治疗提供新的思路和治疗途径对于从根本上提本病的治疗效果有着重要意义信号转导通路是在脊椎动物胚胎期神 经发育和分化中起着至关重要的作用的一条信号通路参与脊椎动物神经发中细胞命运和胚胎范型的决定在早期途径可以通过不同时空的特异表达决定神经管中来自腹部区域的细胞发育为运动神经元而来自背区的细胞 则发育为感觉神经元在后期该通路可以通过与其他一些信号因子的协同作用如等对神经系统细胞的精细分化进行调节在与神经系统的疾病联系方面在未成熟的个体途径配体的突变将会导致一种叫做前脑无裂畸形的发育缺陷性疾病对面部和神经系统的中线产生影响在成熟的个 体途径的过度激活是多种神经系统月中瘤发生及恶性生物学行为维持的重要 原因其中包括神经胶质瘤蛋白家族是通路下游具有锌指结构域的转录因子也是途径在受到外界信号刺激后做出对一系列靶基因进行调节这一反应功能的最终执行者该蛋白家族中既有激活因子也包括抑制因子而是通路下游末端重要的转录激活因子其表达水平的高低是通路激活程度的标志基因由在年发现由于其在脑胶第二军医大学博士学 位论文质瘤中较正常对照组织扩增高出大约倍而得名通路在神经胶质瘤的发生发展中起重要作用参与调节胶质瘤细胞的生长胶质瘤月中瘤干细胞的 自我更新的维持并与其成瘤能力关系密切水通道蛋白是分布在生物膜表面能够对水分子进行高效特异的跨膜转运的一类通道蛋白家族最初在年由等人对红细胞膜分离纯化多肽时发现随后的研究证明了其特异转运水分子的功能并将其命名为的发现更新了人们长期以来的水跨生物膜的移动仪靠单纯扩散的观念使人们一些生理病理的过程及机制有了更加 合理和深刻的认识迄今为止已经在哺乳动物体内发现了种水通道蛋白在中枢神经系统中主要分布的是在下常生理条件下在人主要表达于脑脉络膜上皮微绒毛的顶膜与酶共同定位于该组织在脑脊液产生过程中具有重要作用并参与调节水和离子平衡在发育过程 中从妊娠个月胎儿的脑组织中兀始检测出随后其表达部位和量随月龄增大而相应变化可能与胎儿脑内水平衡的调节有关在脑的发育中起重要 作用在正常脑组织中的表达水平很低在神经胶质瘤中主要表达于微血管内皮细胞和瘤性星形细胞在转移瘤的微血管内皮细胞和反应性 星形细胞中表达主要在神经胶质瘤的进展过程中发挥作用由于胶质瘤细胞的生长环境是在结构致密空问局限的中枢神经系统所以其向周围组织的 浸润性生长主要依靠其通过变形运动插入到神经元周围的空隙中来实现引表达 水平高的胶质瘤细胞在体内外实验中表现出更强的侵袭转移特性因为此 类细胞具有更强的变形运动能力更有利于向周围组织扩散性增殖此外还与脑胶质瘤旁的月中瘤周围组织水月中的发生发展有着密切的关系尽管 在脑脊液分泌大脑内水平衡的调节以及胶质瘤的发展中起着重要作用并且人们对于其自身的通道结构已经有了清楚的了解但是对于其表达的调节机 制仍不清楚尤其是其与主要信号转导通路之间的关系目自订仍然研究的很少在 人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究信号通路与在中枢神经系统的发育及正常功能的维持中都起着重要的作用在中枢神经系统胶质细胞瘤的发生发展中两者也都各自体 现出重要的影响但是对两者之间关系的研究目前尚未见报道本课题从神经胶质 瘤组织标本入手首先分析了两者之问的表达的相关性发现了与在胶质细胞瘤中伴随性高表达这一现象然后通过分子生物学实验对通路通过其下游转录因子对进行调控的可能性及机制进行研究最后对这种调控作用对胶质瘤细胞生物学功能的影响进行了初步探讨第二军医大学博 士学位论文材料和方法一材料主要化学和生物试剂普通试剂琼脂糖琼旨公司十二烷基肌酸钠公司蛋白陈及酵母提取物公司冰乙酸上海试剂一厂甲醇上海试剂一厂无水乙醇上海试剂一厂碱公司各种限制性内切酶酶连接酶公司公司滤纸公司公司硝酸纤维素膜膜公司等特殊试剂及试剂盒公司检测系统公司产物纯化试剂盒胶回收试剂盒为上海赛百盛基因技术有限公司产品各种寡核甘酸链引物使用相关软件自行设计均由上海生工生物工程有限公司合成测序工作送交英骏生物技术有限公司完成荧光素酶定量检测试剂盒为公司产品细胞核染色试剂购自公司澳化乙锭为转染公司产品质粒纯化试剂盒公司试剂公司蛋白定量试剂盒公司细胞活力分析试剂一购自日本同仁化学研究所细胞侵袭实验板购自公司细胞外基质试剂购自公司载体菌株和抗体购自载体真核表达载体质粒为本为公司产品实验室所有宿主菌和均由合作单位德国马普生化所提供公司单抗购自抗体抗抗体抗抗体购自康成生物有限公司羊抗兔及羊抗小鼠二抗购自华舜公司荧光二抗购自公司质粒真核表达质粒由谢经武教授惠赠在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究一表达质粒干扰质粒报告基因质粒质粒均由本室构建细胞及培养用主要试剂及制备方法人胚肾上皮细胞人神经胶质瘤细胞购自中科院细胞库液体培养基取培养基于粉公司包加入碳酸氢钠完全培养基液体培养基添加胎牛血清三抗三抗青霉素链霉素庆大霉素配成后的除菌滤膜过滤保存备用胎牛血清购自公司胰蛋白酶购自公司细胞冻存液液体培养基二甲基亚碉主要缓冲液裂解液临用前加入X凝胶加样缓冲液澳酚蓝甘油嘶在去离子水中溶解碱和甘氨酸然后加入的电泳级储存液用离子水补至则成储存液室温密闭保存蛋白转移缓冲液甘氨酸碱甲醇丽春红三氯醋酸磺基水杨酸第二军医大学博士学位论文封闭液脱脂奶粉溶解缓冲液的配制称取碱加入去离子水磁力搅拌下完全溶解用约浓盐酸调节值至去离子水定容至室温保存备用碱加入去离子水磁力搅拌下完全溶解称取用约室浓盐酸调节值至去离子水定容至温保存备用称取加入去离子水磁力搅拌下完全溶解用约浓盐酸调节值至去离子水定容至室温保存备用加入去离子水磁力搅拌下完全溶称取解用约浓盐酸调节值至去离子水定容至室温保存备用处用理的去离子水充分溶解加数滴浓调节值至并将体积调节至保存在的条件下溶解于去离了十二烷基磺酸钠水中加数滴浓盐酸调节值至冷却后去离子水定容至室温保存主要仪器和设备仪型紫外分光光度计型一超低温冰箱型机型在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究各种离心机型型型转膜仪恒温水浴振荡器型哈尔滨东联电子技术开发有限公司恒温水浴箱一型上海天平仪器厂超净工作台苏州净化设备公司凝胶成像系统上海四星生物技术公司免疫组化石蜡包埋机公司免疫组化制片仪公司免疫组化冰冻切片仪公司荧光实时定量仪公司荧光素酶检测仪器紫外透射反射分析仪型上海长明光学电子仪器厂显微镜荧光显微镜电泳仪型型制冰机公司三二研究方法针咒万法标本来源及处理人神经胶质瘤石蜡包埋组织标本来例源于年月至年月在长海医院神经外科手术切除的患者经病理组织学检查确诊其中分级IV级例其余均为IV级下常对照两例于正常脑组织内减压术中获得冰冻组织标本例其中分级级例II级例IV级例IV级例正常对照组织例免疫组织化学石蜡切片烤箱过夜切片脱腊至水二甲苯一二甲苯一二甲苯一乙醇第二军医大学博士学位论文乙醇一乙醇一乙醇一双蒸水甲醇液室温放置X双蒸水洗抗原修复切片放入柠檬酸盐缓冲液中煮沸停火再煮沸自然冷却至室温双蒸水沈封闭c甩去封闭液不洗直接加一抗置入湿盒中然后冰箱过夜时C取出室温复温 x然后洗滴抗C沈x显色镜下观察双蒸水终止显色苏木素复染秒分化后自来水返蓝蒸储水浸泡脱水透明盖玻片覆盖显微镜下观察阳性染色在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究免疫印记取等量神经胶质瘤组织液氮中磨碎加入裂解缓冲液冰浴超声破碎细胞置恒温离心机内离取上清蛋白定量试剂盒进行蛋白定量取出所需量蛋白加入加样缓冲液变性变性样品进行蛋白电泳通过电转仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜公司脱脂奶粉封闭洗三次每次稀释一抗孵育洗三次每次脱脂奶粉稀释二抗孵育洗三次每次化学发光法显影细胞培养胚肾上皮细胞入神经胶质瘤细胞细胞用培养置孵箱中培养保持饱和湿度消化取待传代细胞培养瓶皿轻弃培养基预温少许轻洗一遍弃去加少许胰酶室温放置数分钟至瓶壁出现针孔样弃去胰酶加少量新鲜培养基终止消化轻轻吹打待成单个细胞后传代冻存生长对数期细胞约X胰酶消化数分钟用完全培养基中止吹打成单个细胞离心分钟将细胞沉淀悬浮于冻存液胎牛血清中转移到冻存管中小时一 C小时液氮管而后放进液氮中复苏准备温水视复苏细胞管数多少将从液氮罐中取出的细胞迅速在水中融化不断搅动转移细胞于加有新鲜完全培养液的培养瓶中培养次日更换培养液质粒的构建启动子区报告基因质粒及突变体质粒的构建方法启动子区全长及各突变体质粒物见下表其中各突变体质粒采用第二军医大学博士学位论文重叠延伸法进行构建条件如下变性退火C延伸C个循环电泳鉴定构建方法上游引物均引入酶切位点下游引物均引入酶切位点得到的产物进行胶回收再用酶切与用同样双酶切酶切回收后的质粒进行连接转化感受态菌氨苇抗生素筛选阳性克隆用酶切初步鉴定正确后再送测序鉴定确认突变位点正确后再用于后续实验质粒名称引物干扰质粒质粒的构建人工合成针对人中部碱基处的反向互补序列端加端加入粘性木端序列如下合成后上下游寡入粘性术端核甘酸链在 溶液中于沸水浴中后自然冷却即得到双链的带粘性末端的有矛片段质粒用酶切回收然后进行连接转化感受态菌卡那抗生素筛选阳性克隆片段是否接入用测序鉴定鉴定正确后在体外验证其干扰效果一表达载体的构建在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究网站检索得到序列根据JT放读码框设计引物序列如下上游引物引入 酶切位点下游引物引入酶切位点以抽提的大鼠肾脏组织为模板扩增胶回收后用酶切质粒同样进行双酶切后回收片段载体进行连接然后进行连接转化感受态菌氨苇抗生素筛选阳性克隆酶切鉴定细胞转染脂质体法公司在培养皿中接种适量细胞使之培养后汇合率达到在不同离心管中分别加入无血清分别加入肛质粒和脂质体分别混匀后室温放置将溶液和脂质体溶液混合轻柔混匀室温放置转染前细胞用预温的无血清洗涤一遍加入无血清随后将质粒一脂质体复合物滴加至细胞表面置孵箱内培养后吸去一脂质体复合物加入含的培养基继续培养裂解细胞提取总蛋白法公司在孔培养皿中接种适量使之培养后汇合率达到在不同离心管中分别加入生理盐水并混匀随即将溶液加入溶液振分别加入质粒和荡混匀室温放置将质粒脂质体复合物滴加至细胞表面置孵箱内培养裂解稳定转染细胞转染后胰酶消化按传代细胞贴壁后加入培养以维持其性状两周左右挑取单克隆细胞抽提待六孔板中细胞生长至汇合度室温孵育加入加入氯仿剧烈振荡室温孵育C离心吸取上层含有的水相入新管加入异丙醇沉淀室温孵育离心第二军医大学博士学位论文弃上清加入的乙醇洗涤矶沉淀C离一水溶解干燥用用紫外分光光度计测定的含量保存准备做操作步骤合成第一链总随机引物立星丞鱼丛C冰浴至少x肛CCC在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究反应取上述合成的为模板按列反应体系进行扩增槿拯坠加水至总体积为轻轻混合预变性变性退火延伸至个循环C终木延伸产物用琼脂糖胶电泳分析荧光素酶报告基因检测在孔或孔板中接种细胞使小时后汇合率为瞬时转染荧光素酶报告基因和的基因小时后裂解细胞采用公司双荧光报告基因检测试剂盒进行检测细胞增殖速率比较取对数生长期细胞传代消化以每孔个的密度接种入孔板并设个复孔在后加入十分之一体积的工作液孵育小时后放入酶标仪以波长检测取平均值比较差异体外侵袭实验基质胶准备将冻存于度冰箱的度过夜变成液态取无血清培养基加入或每室混匀操作最好在冰浴上加入上室各个室放入培养箱中孵育此间经常观察当出现白色层时说明已经变为固态注释无血清培养基和基质胶按稀释每孔加在c培养箱中消化细胞无血清培养基洗次计数配成细胞悬液用无血清培养基洗洗次每孔加入细胞悬液第二军医大学博士学位论文下腔室中加入含有条件培养基C培养箱中孵育取出用洗遍戊二醛固定加入结晶紫染色或染色室温洗遍用棉球擦去上表面细胞显微镜下观察取随机个视野细胞计数染色质免疫共沉淀部分剪切X细胞于培养瓶中准备x细胞培养基为甲醛C置直接加入于冰上终止反应尽量吸尽培养基用含冰冷洗涤次管反复吹打细胞吸取悬液移入C离心融化裂解液并加入和裂解液再悬细胞冰上x次间隔冰上超声剪切至大小加入C以解除交联苯氯仿法提取琼脂糖凝胶电泳观察剪切效果注卜注意冰上操作通过改变超声功率间隔次数优化条件通过电泳判断片段大小经验表明尖端最大功率间隔次可使之优化一旦优化则固定细胞数量部分免疫共沉淀接离心转移上消至离心管稀释缓冲液稀释上消至体积并加入蛋白酶抑制剂从中取出进入用于定量加入蛋白鞋精琼脂于稀释上清以纯化摇动选中速下同离心以沉淀琼脂转移上泊于新管乂加入抗体摇动过夜背景对照则不加抗体直接使用蛋白鞋精琼脂摇动直接进入加入蛋白鞋精琼脂摇动以收集抗体转录因子复合体在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究离心以沉淀琼脂尤其小心移除上清内含未结合及非特异可提取并按以下顺序洗涤蛋白鞋精复合体每种缓冲液加室温摇动离心低盐免疫复合体洗液次高盐免疫复合体洗液次免疫复合体洗液次缓冲液次注步取出上清用于不同样本定量此作为C置以解除蛋白交联见初始样本而且需要通过加入经过后样本为蛋白抗体转录因子复合体部分沈脱结合于转录因子的按体积配制配制新鲜洗脱缓冲液和接加入沈脱液以使转录因子复合体与蛋白抗体解离简单振荡混匀室温摇动离心以沉淀琼脂小心转移上泊于新管并重复沈脱次混合次洗脱上清以解除转录因子交联置加入此后样本可放入一于明同进行后续实验应同时包括的初始样本阴性对照和背景对照组样本用于巢式若结果不理想可进行下面步骤以纯化注意小心操作某些可能在纯化过程中丢失部分苯氯仿法提取依次加入蛋白酶C水浴对于优化条件加入和振荡混匀加入苯氯仿抽提液剧烈振荡静止使分层室温第二军医大学博士学位论文离心小心吸取上清加入糖原醋酸钠乙醇混匀放置一c c离心弃上清醇洗涤次离心弃去上清并倒扣挥发乙醇加入续则使用缓冲液冲洗吸附在管壁上的一冰箱保存部分扩增反应验证结合作用按体系依次加入上游引物下游引物灭菌水循环使用然后CCC共个循环琼脂糖凝胶电泳上样观察结果染色细胞多聚甲醛固定洗处理洗三次每次在人胺贡瘤中对水通道蛋白调控作用的研究染色洗三次每次甘油覆盖荧光显微镜下观察主要引物列表医太学博士学位论文实验结果一胶质细胞瘤月中瘤组织标本中及表达水平的检测为了明确在胶质瘤组织样本中通路下游转录因子与的表达情况我们首先进行了免疫组织化学实验免疫组化结果提示分级mIV级和IV级神经胶质瘤组织与正常对照组织相比通路呈现出异常活化状态通路下游转录因子异常高表达阳性着色主要分布于变异肥大的星形胶质细胞的胞核与胞浆内图瀑眷潦蕤在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研先第二军医大学博士学位论文七图神经胶质瘤组织中免疫组织化学染色分级为IV级的神经胶质细胞瘤及中免疫组化染色结果正常对照组织肿病组织中呈现出异常的高表达阳性染色主要分布于肥大变形的星形胶质细胞的胞膜表面图片放大倍数为中间插入的局部放大图为在同一胶质细胞瘤组织标本中与的高表达的区域呈现出比较特异的相关性图在人肢质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究一灌夥瓣繁蒸麓辅第二军医太擘博士学位论文糕麓一图神经胶质瘤细胞及神经胶质瘤组织标本中与的免疫荧光共定位表达情况使用一抗来源不同的与抗体抗二抗使用标记早现红色荧光抗二抗使用标记呈现绿色荧光神经胶质瘤细胞中与的特异性共定位情况神经胶质病组织中特异性共定位图中可见主要分布在胞浆和胞膜表面作为转录因子主要定位于胞棱高表达的细胞或组织区域也呈现出特异性高表达在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究初步明确与在胶质细胞瘤中的伴随高表达现象之后为了进一步验证免疫学结果选取例分级不同的胶质瘤冰冻组织标本使用液氮研磨裂解法提取总蛋白分别检测月中瘤组织标本巾与的表达水分析其相关性我们发现与免疫组化的结果一致与之间的伴随表达现象在分级不同的标本中更为明显总的趋势是与的表达水平都随着胶质瘤恶性程度的增加逐渐升高图刮神经歧厦籀组簪小车川收选水不同分级的胶质瘤其中分级级例m级例m iv级例iv级例中与表达町见与的表逃在小同分级的月中瘤组织中表现出照好的一致性总的趋势是两者的表达部随着胶质瘤恶性程度的增加而增强为正常脑组盆二转录因子对的调控作用及其机制可咀显著上调含有启动子区的报告基因活性神经胶质瘤组织标本中与表达之间的伴随关系提示下游转录因子可能对的表达具有调控作用为了验证这个初步的设想我们在和神经胶质瘤细胞系中分别共转与含有启动子区的报告基因质粒结果发现的表达可以在两种细胞系中激活的报告基因活性并且随着转入量的增加的报告基因活性也逐渐升高表现出较好的剂量依赖性图第二军医大学博士学位论文怎墨叮价慧一 8一OO碰OOOO 阳 OOOOOO 的扣 OO一沁OO卯篁冒毋价母垃OOOO-8 图对含有启动子区的报告基因激活作用在及中共转与之后报告基冈的激活情况与对照组相比可以显著增强报告基冈的活性并且这种激活作用随着转入量的增加而增强表现出剂量依赖的特点可以上调的和蛋白表达水平在胶质瘤组织标本和报告基因的结果都提示通路下游转录激活因子很有可能对水通道蛋白的表达具用调控作用我们随之在人胚肾上皮细胞中进行了预实验来验证该假设外源性在中转及蛋入收获不同时间点细胞及检测在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究白表达水平结果发现转入的细胞与对照组相比的表达增强这种增强作用随着时问的延长更加明显与表达的增强情况相一致表现出较好的时间依赖性在中外转剂量梯度增加的后检测的表达水平发现的表达随着转入剂量的增加而升高表现出较好的剂量依赖性图瓢月中硼匿三三三孙第二军医走学博士学位论文墨塑哆图中外转对在转录水平的上调作用在中与转入的对照质粒相比较的过表逃可以使的表逃随着时问的延跃行增加表现山时间依赖的特点在中以梯度剂量转入厉可以使的表达水平梯度升高表现出剂量依赖的特点恤曲扑在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究 一妒口拿山H已洲 图中外转对在蛋白表达水平的上调作用在中与转入的对照质粒相比较的过表达可以使的蛋白表选随着时间的延长而增加表现出时间依赖的特点在中以梯度剂量转入斤町以使的蚩白表达水平梯度升高表现出剂量依赖的特点在细胞中验证了对的上调作用之后为了了解这种可能的调控机制是否具有普遍性我们又在神经胶质瘤细胞系中重复了上述实验结果发现在中转入过表达质粒后与对照组相比较的及蛋白表达水平都有了显著升高并且这种升高也表现出时间和剂量依赖性第二军医大学博士学住论文引墨五三亘蔓亟亘圄厩皿盂磴出器地埔瞄显懂蟆8出 业口瑚VI皿山8刈鞠OO一触