1DNA片段的预扩增课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,Procedures for AFLP,AFLP反应程序主要包括模板DNA制备，酶切片段扩增及凝胶电泳分析这3个基本步骤。各步骤具体的过程有：,首先要制备高分子量(HMW)基因组DNA，选择6个碱基识别位点的限制性内切酶(通常是,Eco,RI或,Pst,I或,Sac,I)。,酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。,1.DNA片段的预扩增。,2.在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。,3.PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。,4.多态性比较分析，特异片段回收克隆分析,AFLP,Characterization of AFLP,理论上，可以采用的限制性内切酶及选择碱基的种类、数目很多，所以标记数目是无限的。,每次谱带在50-100条之间，多态性检测非常有用,呈典型的孟德尔方式遗传,可用于作为遗传图谱和物理图谱的位标。,可用于分析基因组DNA、克隆的DNA大片段，,对模板浓度不敏感，即使模板浓度存在差异，也会得到强度一致的谱带。,AFLP,Adaptor for AFLP,AFLP引物是一种人工合成的单链核苷酸，一般长度为18-20bp.由核心顺序（Core）、内切酶位点特异顺序（ENZ）和选择性核苷酸顺序（EXT）三部分组成。如下图：,AFLP,核心顺序（,core,）,ENZ EXT,Eco,RI,引物：,5-GACTGCGTACCAA TTC NNN-3,Mse,I,引物：,5-GATGAGTCCTGAG TAA NNN-3,Pre-amplification,酶切片段要经过连续2次PCR扩增，通过这样两步扩增反应使产生的扩增结果更清楚、重复性更好。,第一次PCR扩增被称为预扩增反应，所用的AFLP引物只含有1个选择性核苷酸，选择扩增性能较差，因此大量的扩增产物在凝胶中往往形成连续一片。预扩增反应条件与常规PCR反应条件大致相同。,预扩增反应的产物经过大量稀释后作为第2次扩增放映（选择性扩增）的模板,AFLP,Selective Amplification,选择性扩增的反应条件与普通PCR有所不同，主要不同之处是复性温度，它是采用温度梯度PCR,其PCR开始于高温复性（一般采用65 C）以期获得最佳选择性。以后复性温度逐步降低，一直降到复性效果最好的温度（一般是56C），然后保持这个温度下复性，完成其余的PCR循环周期。,AFLP,Procedures for AFLP,AFLP,Procedures for AFLP,AFLP,AFLP标记,不需要基因组的信息,重复性较高,DNA需量少,高多态性、高效率、高精确性,可标记整个基因组,AFLP,优点：,缺点：,被认为是显性标记,什么是,Single Nucleotide Polymorphisms(SNPs)?,ATGGTAA,G,CCTGAG,C,TGACTTAGCGT-AT,ATGGTAA,A,CCTGAG,T,TGACTTAGCGTCAT,SNP SNP indel,SNPs result from replication errors and DNA damage,They are a polymorphic bit state at a nucleoside address,Haplotypes SNP Barcodes,ATGGTAA,G,CCTGAG,C,TGACTTAGCGT-AT,ATGGTAA,A,CCTGAG,T,TGACTTAGCGTCAT,Types of Molecular Markers,RFLP-restriction fragment length polymorphism(pm)（,限制性片段长度多态性,）,VNTR-variable number tandem repeat（,变化数目的串联重复,）,RAPD-random amplification of polymorphic DNA（,随机扩增的多态性DNA,）,AFLP-amplified fragment length pm（,扩增片段长度多态性,）,SSR-simple sequence repeat（,简单序列重复,）,12,Application of Molecular Markers,Applications,1.种质评价和核心种质筛选,鉴别品种和品系；检测资源多态性；,鉴定新种质；核心种质筛选,2.分子标记早期辅助选择,育种亲本选择；育种过程监测；早期分子辅助选择,（marker assisted selection,MAS）,3.构建遗传连锁图,基因定位（QTL);比较基因组研究;基因克隆（图位克隆）,4.生物起源和进化研究,品种鉴别与产权保护,定义：能够鉴定作物品种之间差异的电泳图谱。特点：高度的个体特异性、环境的稳定性及丰富的多态性。,用途：鉴定品种真实性和纯度，用于新品种登记和品种知识产权保护等。其中AFLP被推荐为指纹图谱绘制的最佳方法之一。,品种的,DNA,指纹图谱,引自庞晓明博士论文（,2002,）,分子标记辅助选择,（MAS,marker assisted selection),分子标记辅助选择几乎不受环境条件的影响，还可以跟踪外源基因，克服回交的缺点，可大大提高选择的效率。,长期以来，选择都是基于植株的表型性状进行的。植物的许多性状为数量性状，受许多微效基因的控制，且易受环境的影响。,DNA标记的出现使植物育种从表型选择过渡到分子育种的新阶段。,快速有效地选择出带有目标基因的单株,表现在:,1.不受环境条件及生长发育阶段的影响，在苗期或低世代就可进行筛选;,2.利用共显性标记可直接对隐性目标基因进行选择，无需测交或自交检验;,3.如果目标性状不能在当代进行选择，采用MAS可直接在当代确定。,这是,2005,年发表在,PNAS,上关于蔷薇科果树分子标记辅助育种的文章，共列出了,29,个外形或是农艺性状的基因或标记。,2002年，在李上Bergougnoux 等报道了抗线虫的多个分子标记，包括3个RAPD标记，1个AFLP标记，3个SSR标记。其中的一个RAPD和AFLP标记成功地转化为SCAR标记。并在桃和杏的多种组合中验证了该标记作为分子辅助筛选的可靠性。,NY54,EF,Progeny,Genomic Resources to Improve Fruit Size and Quality Traits in Cherry,Amy Iezzoni,Wayne Loescher,Dechun Wang,&,Esther van der Knaap,快速选出特定遗传背景的单株,在育种中不仅要考虑优良性状的导入，还必须考虑保持其整个基因组的遗传背景基本不变。,通过MAS技术，借助于饱和的分子标记连锁图，对各选择单株进行整个基因组的组成分析，进而可以选出带有多个目标性状而且遗传背景良好的理想个体。,基因聚合,将多个有利基因通过选育途径聚合到一个品种之中,这些基因可以控制相同的性状也可以控制不同的性状。,基因聚合突破了回交育种改良个别性状的局限,使品种在多个性状上同时得到改良。,园艺作物的报道,关于基因聚合和或是组合多个,QTL,的策略在水稻上，特别是水稻抗病育种得到广泛的应用。在园艺作物的蔬菜也有应用。左边的报告就是关于番茄果实,QTLs,的。,在果树上也有应用前景，右边的报告作者是,2003,年提出了在果树上应用基因聚合或是组合多个,QTL.,利用遗传图和遗传标记可用来加速植物育种进程。,经典遗传图谱：形态、生理和生化标记，数量极为有限，图谱分辨率大都很低，表现标记少，图距大，饱和度低。,分子标记技术的发展，使图谱上标记的密度越来越高。,以具有遗传多型性的分子标记为“路标”。,植物基因组遗传作图,目前，果树作物的做图发展迅速：在甜橙已发表的遗传图中，已有,200,多个标记。蔷薇科果树还专门建立了做图网站：,.,里面已搜集了苹果、梨、桃、杏、李、樱桃、树莓等果树的多个杂交组合的图谱。,2008,年,7,月发表在,Plant Physiol,上的蔷薇科果树遗传标记和遗传图,产量、品质、熟期等大多数重要农艺性状，均表现数量性状的遗传特点，受许多数量基因座位,（Quantitative Trait Loci,QTLs）,和环境因子的共同作用。,数量遗传学无法确定控制,数量性状的QTLs,数目，也无法确定单个,QTL的遗传效应及染色体位置。,分子连锁图谱的发展，可以实现对单个QTL遗传效应的追踪，从而应用于分子标记辅助选择。目前已发展了QTLs定位,的多种方法。,数量性状基因的定位,QTL,作图所需的数据,遗传标记数据,数量性状数据,基于图谱的基因克隆,图位克隆,条件：,(1)目标基因附近紧密连锁的DNA标记；,(2)知道这些标记与目的基因的位置,一旦建立与目的基因紧密连锁的分子标记图，就可以找到染色体步行的起始点，从而进行定位克隆。,通过图位克隆得到的基因大都来源于模式植物，必须拥有高密度的分子图谱。对于果树作物来说，这条途径几乎不可行。,比较基因组研究,利用相同的DNA分子标记（主要是cDNA标记和基因克隆）在相关物种之间进行遗传或物理作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布特点，揭示染色体或染色体片段上的基因及其排列顺序的相同或相似性，并由此对相关物种的基因组结构和起源进化进行分析。,这种标记也叫可转移标记（portable/transferable marker.),新发现：不同物种之间在标记探针的同源性、拷贝数及连锁顺序上都具有很大程度的保守性。,番茄、马铃薯和辣椒（Tanksley等1988；1992）；,蔷薇科苹果属和梨属之间的共现性（Dirlewanger 等，2004）,启示：模式植物上遗传作图成果可推而广之。可借助比较基因组共享分子标记，使建立高密度遗传连锁图可资利用的标记显著增加，从而大大提高了获取离目标基因很近分子标记的的可能性。,蔷薇属遗传图与抗白粉病性状的,QTL,定位（左一），中间和右边的连锁图分别是是李属（,Lalli,等，,2005,）和苹果属（,Calenge,等，,2005,）的连锁图与抗白粉病,QTL,定位。,植物遗传多样性、起源、分类和进化研究,对植物种质资源遗传多样性的全面了解，对于拓宽遗传基础的育种策略十分重要。,植物的遗传多样性是品种遗传改良的基础。,芸香科起源、分类和进化研究,引自李映志博士论文（,2007,）,甜橙起源分析,33,柚子来源 ：橘子来源,1 :3,Sweet orange SSR markers,(307),Mandarin-hereditary,P1 P2 O M1 M2,(147),Pummelo-hereditary,P1 P2 O M1 M2,(55),P1 P2 O M1 M2,(105),Common,etc,C.grandis,Pummelo,C.sinensis,Sweet orange,C.reticulata,Mandarin,C.reticulata,Mandarin,Somatic mutations,Inter-specific hybrid,Todays sweet orange cultivars,引自,Nature Genetics 45:59-66,苹果进化故事,34,研究 鉴定了,15,个在苹果中特异表达的,MADS-box,因子，为梨果性状的形成机理提供了重要的信息,Nat Genet 2010,48:833-839,苹果所在的梨族发生了近期的全基