传代培养及细胞计数

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,动物细胞工程实验,传代培养及细胞计数,实验目的,掌握传代培养的一般方法和步骤以及培养过程中的无菌操作技术。,熟悉培养细胞的观察方法。,学习血球计数板的计数方法。,实验原理,细胞在培养,皿,长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。,传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分,皿,就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分,皿,。,实验用品,仪器：,培养箱（调整至,37,）、培养皿、超净工作台、倒置相差显微镜。,材料：,卵巢癌细胞,HO-8910,。,试剂：,1640,培养基（含血清,10%,）、,0.25%,胰蛋白酶、,75%,消毒酒精。,实验步骤,实验前将无血清培养基和含血清培养基分装并进行温育（,37,）。,以温度计实际显示温度为准！,实验步骤,将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。,实验步骤,用不含血清,1640,培养基冲洗细胞。,实验步骤,将无血清培养基吸出，,加入,0.25,胰蛋白酶溶液,1ml,，使细胞都浸入溶液中。,实验步骤,消化,30-40s,后，弃去胰酶,，加入含血清,1640,培养基,2ml,，终止消化，并充分吹打。吹打后将悬浮起来的细胞转移到,15ml,离心管中，,1000rpm,离心,5min,。,实验步骤,离心后，弃上清，加含血清,1640,重悬，混匀，取,50ul,用于细胞计数。,实验步骤,血球计数板的计数原理,实验步骤,根据细胞计数的结果，用含血清的培养基调整细胞浓度到,1X10,5,个,/ml,。分至两个培养皿中，做好标记，继续培养。,实验完毕，将培养基瓶口迅速过酒精灯火焰消毒，拧紧后，封口膜密封。拿出超净台，放入冰箱。,实验后，请将超净工作台内擦拭干净，酒精喷洒消毒，并将酒精擦干净，打开紫外灯灭菌。用过的离心管和血球计数板须清洗干净。,各个实验小组的同学负责将垃圾带走，值日生打扫实验室卫生。,实验步骤：,9,、实验后的整理工作,实验报告,试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤。,传代培养时要注意严格的无菌操作，并防止细胞之间的交叉污染。,酶解消化,要适度,，消化过度会对细胞造成损害，消化不够则难于将细胞解离下来。,传代后,第,2-3,天观察细胞生长情况，了解细胞是否健康生长：健康细胞的形态饱满，折光性好。,掌握好代传代时机：健康生长的细胞生长致密，即将铺满瓶底时，即可传代,。,思考与讨论,细胞传代培养的目的是什么？,判断细胞健康的标准是什么？,