小鼠肝脏RNA的抽提纯化与鉴定课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,小鼠肝脏RNA的抽提纯化与鉴定,实验目的,掌握,RNA,操作注意事项,了解鉴定,RNA,含量和质量的方法,了解,RNA,抽提原理,熟悉,RNA,抽提方法,实验原理,理论基础：,真核生物结构基因有内含子,基因在转录水平的表达,实验原理：四步骤,组织或细胞匀浆,分离总,RNA,纯化,RNA,检测,RNA,的纯度及完整性,理论基础,真核生物中绝大多数基因有内含子，如直接由基因组克隆目的基因，不利于编码基因的序列分析及体外利用原核细胞表达。提取,RNA,并逆转录形成,cDNA,或构建,cDNA,文库是获取真核生物表达基因的主要手段。,检测基因在转录水平的表达，需检测,mRNA,含量，定量,RT-PCR,是主要方法之一。,内含子,外显子,实验原理,抽提,RNA,的关键在于去除,DNA,与蛋白质，常用酸性酚法。在酸性条件下苯酚可溶解,DNA,而不溶解,RNA,，同时酚又是蛋白变性剂。利用酸性酚试剂加氯仿共抽提，可一步完成细胞的裂解以及蛋白质与,RNA,的分离。最后利用异丙醇沉淀，即可获得纯化的总,RNA,。,RNA产物的鉴定,RNA,的纯度与含量用紫外分光光度法检验。,高纯度,RNA,的,A260/A280,应处于,1.6,至,1.8,之间，,A260,与,RNA,浓度呈正比，,1 OD=40g/ml RNA,。,RNA,的完整性可通过电泳检测,RNA,为单链分子，二级结构复杂，需先经甲酰胺变性，再进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。,细胞总,RNA,以,rRNA,含量最高，电泳时可观察到,18S,与,28S,rRNA,两条清晰条带，且亮度之比接近,1:2,，表明,RNA,没有发生降解。泳道前缘还可观察到一条较为模糊且亮度较弱的条带，主要由,5S,、,5.8S,rRNA,与,tRNA,组成。,RNA电泳结果示意图,28S,18S,5S,RNA电泳结果凝胶成像图,28 S,18 S,5 S,取小鼠肝组织匀浆,处死小鼠,匀浆,取肝50,100g,Trizol 1ml,匀浆,RNA纯化操作步骤,加入氯仿,0.2ml,，剧烈振荡，室温放置,10,分钟。,12000rpm,离心,15min,，取上清。,（离心后溶液分为三相，即上层的水相、下层的有机相以及中间的变性蛋白。小心吸取上层水相，绝不能有中层蛋白混入。）,加入异丙醇,0.5ml,，振荡混匀，室温放置,10,分钟，,12000rpm,离心,10min,，弃上清。,（加入,50,的异丙醇沉淀核酸。异丙醇的用量应与以上所取上清液的体积相当。）,1ml 75,乙醇洗涤沉淀，,12000rpm,离心,5min,，重复一次。,空气干燥沉淀，溶解于,20l DEPC-H,2,O,。留样,2l,，其余,70,保存备用。,RNA电泳操作步骤,制备琼脂糖凝胶：首先将,0.5g,琼脂糖溶化于,32ml,水，冷却至,60,。加入,5,甲醛变性凝胶电泳缓冲液,10ml,，,37,甲醛水溶液,9ml,，混合均匀并灌制胶板。,取,1l RNA,溶液，加入甲酰胺,-,上样缓冲液,9l,，,95,变性,5,分钟，迅速冰浴冷却。点样。,150V,电泳,30,分钟，紫外灯下观察电泳结果。,分光光度法操作步骤,加,1l RNA,溶液于,0.4ml DEPC-H,2,O,，充分混匀，读取,260nm,与,280nm,的吸光度数值。,操作注意事项（一）,因为,RNA,酶分布广、活性强、且难以失活，使,RNA,极易降解，操作时应特别注意：,高压消毒实验器皿，烤干。,以,0.1%DEPC,过夜处理所有试剂配置用水，并高压消毒。,抽提,RNA,时，应戴手套和口罩，少说话。,操作注意事项（二）,DEPC,是强烈的烷化剂，通过与,RNA,酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制,RNA,酶活性，是消除外源性,RNA,酶的主要方法。但,CEPC,有致癌作用，并具有很强的反应性，因此注意：,使用时，不直接接触,DEPC,处理的器皿和水必须经高压灭菌处理，使,DEPC,分解后使用。,操作注意事项（三）,为避免酶蛋白反复冻溶而失去活性，酶制剂溶于,50,的甘油中，,-20,o,C,储存可保持液状。但高浓度的甘油对酶促反应有抑制作用，因此酶的用量不能超过反应体积的,1/10,。,在进行各种酶促反应时，应首先加水，再加入其它成分，最后加酶。,