实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实时荧光定量,PCR,的原理、操作及其应用,-,分子生物学实验技术,系列讲座,河南农业大学生命科学研究中心,张志坤,大纲,一,.,原理概述,二,.,操作及结果分析,(,一,).,样品制备,(,二,).,引物及探针的设计与合成,(,三,).,标准品的制备,-,质粒或纯化后的,PCR,产物,(,四,).,通道的选择及增益的选择,(,五,).,标准曲线的建立,(,六,).,加样时应注意的细节,(,七,).,阈值的选定,(,八,).,熔解曲线分析,(,九,).,操作流程,三,.,应用,(,一,).,绝对定量分析,(,二,).,相对定量分析及实验方案,(,三,).SNP,检测分析,一、原理概述,1.Real-Time PCR,概论,实时荧光定量,PCR,技术于,1996,年由美国,Applied Biosystems,公司推出，由于该技术不仅实现了,PCR,从定性到定量的飞跃，而且与常规,PCR,相比，它具有特异性更强、有效解决,PCR,污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。,实时荧光定量,PCR,：,在,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整,个,PCR,进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方,法。,定量,PCR,仪是在普通,PCR,仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，,PCR,扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。,常 规,PCR,技术：对,PCR,扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，,无法对起始模板,准确定量，无法对扩增反应实时检测。,实时定量,PCR,技术：,利用荧光信号的变化实时检测,PCR,扩增反应中每一个循环扩增产,物量的变化，通过,Ct,值和标准曲线的分析对起始模板进行定量,分析。,一、原理概述,2.,定量,PCR,常用的三个常用概念,扩增曲线、荧光阈值、,Ct,值,(1).,扩增曲线：反映,PCR,循环次数和荧光强度的曲线，定量,PCR,仪每次轮,PCR,扩增都会自动,录荧光强度的变化,每个循环进行一次荧光信号的收集,一、原理概述,2.,定量,PCR,常用的三个常用概念,扩增曲线、荧光阈值、,Ct,值,(2).,荧光阈值：,样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，,手动 设置的原则要大于样本的荧,光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶,段，并且保证回归系数大于,0.99,。,(3).CT,值：,PCR,扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环,次数。,一、原理概述,3.,荧光定量,PCR,所用的荧光报告基团,(1).,非特异性荧光标记：,SYBR Green,(2).,特异性荧光标记：,TaqMan,探针,Molecular Beacon,分子信标,一、原理概述,4.,非特异性荧光染料,-SYBR Green,的特性,(1).SYBR Green,能结合到双链,DNA,的小沟部位,(2).SYBR Green,只有和双链,DNA,结合受激后才发,荧光,(3).,变性时，,DNA,双链分开，无荧光,(4).,复性和延伸时，形成双链,DNA,SYBR Green,发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,SYBR Green,一、原理概述,4.,非特异性荧光染料,-SYBR Green,的工作原理图解,5,3,5,3,SG,No Emission,SG,SG,SG,Excitation,SG,SG,SG,SG,SG,SG,SG,5,3,5,3,Emission,Excitation,伴随着每轮,PCR,的进行，特异的基因片段不断积累，,SYBR Green,不断的与新增加的基因片段结合而发出荧光，荧光信号不断积累，荧光定量,PCR,仪实时记录了荧光信号的变化。,一、原理概述,5.,非特异性荧光染料,SYBR Green,的优缺点,优点：,(1).,对,DNA,模板没有选择性,-,适用于任何,DNA,(2).,使用方便,-,不必设计复杂探针,(3).,非常灵敏,(4).,可做熔解曲线分析,(5).,便宜,缺点：,(1).,对引物特异性要求较高,(2).,与非特异性双链,DNA,结合，产生假阳性,干扰实验的准确性,尤其,是分析表达量不高的基因时,这类情况尤其突出,;,需要不断的优化反,应体系,降低非特异性扩增,.,一、原理概述,6.,TaqMan-,水解型杂交探针,与目标序列互补,TaqMan,探针的特性：,(1).5,端标记有报告基团,(Reporter,R),，如,FAM,、,VIC,等,(2).3,端标记有荧光淬灭基团,(Quencher,Q),(3).,探针完整，,R,所发射的荧光能量被,Q,基团吸收，无荧光，,R,与,Q,分,开，发荧光,(4).Taq,酶有,53,外切核酸酶活性，可水解探针,一、原理概述,6.,TaqMan-,水解型杂交探针工作原理,每扩增一条,DNA,分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,一、原理概述,7.,探针法的优缺点,(1).,极高的特异性和准确性,由于探针法除了引物序列的特异性之外，还有探针,序列的特异性，从两个方面保证了所 扩增基因的特异,性。,(2).,良好的重复性,(3).,目前合成价格较贵,.,(4).,不能做熔解曲线分析,.,一、原理概述,8.,荧光定量,PCR,的数学原理,理想的,PCR,反应：,X=X,0,*2n (,扩增效率,=1),实际的的,PCR,反应：,X=X,0,*,(1+Ex)n,n,：扩增反应的循环次数,X,：第,n,次循环后的产物量,X0,：初始模板量,Ex,：扩增效率,一、原理概述,8.,荧光定量,PCR,的数学原理,在扩增产物达到阈值线时,:,XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1),XCt:,荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量,.,在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为,M,方程式,(1),两边同时取对数得,:,log M=log X0(1+Ex)Ct (2),整理方程式,(2),得,:,log X0=-log(1+Ex)*Ct+log M (3),log(1+Ex)*Ct=-log X0+log M (4),Ct=,-log X0+log M,(5),log(1+Ex),Log,（,x0,的初始模板量）与到达阈值时的循环数（,Ct,值）呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即,Ct,值就可计算出样品中所含的模板量,一、原理概述,8.,荧光定量,PCR,的数学原理,模板,DNA,量越多，荧光达到域值的循环数越少，即,Ct,值越小,Log,浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品,Ct,值，就可以计算出样品中所含的模板量,一、原理概述,8.,荧光定量,PCR,的数学原理,25,Sample,确定未知样品的,C(t),值,通过标准曲线由未知样品的,C(t),值推算出其初始量,一、原理概述,9.,认识一下荧光定量,PCR,仪,仪器本身的功能：,1,、控制参数（温度）,2,、控制循环数（时间）,3,、记录整个循环过程中的荧光值的变化，在所有的时,间和温度条件下，仪器都会忠实的记录下荧光值的,变化。,荧光定量,PCR,仪就是通过对所记录的参数来计算样品的初始模板量的。,循环数和荧光值曲线,温度和荧光值曲线,一、原理概述,ABI 7300,型,96,孔荧光定量,PCR,仪，,由于样品间存在光程差，需,ROX,校正,。,RoterGene3000,型,36,孔,荧光定量,PCR,仪，旋转,加热式，不需,ROX,校正,二、操作及结果分析,1,、样品的制备,DNA,样品，主要是,DNA,提取，提取的,DNA,可,TE,缓冲液溶解后,-20,度保存；对于,RNA,样,品，抽提,RNA,后要迅速反转录，将,RNA,反转录为,cDNA,，,TE,缓冲液溶解后可,-20,度保,存。,DNA,或,cDNA,样品也不要长期存放，因为在存放过程中会有少量的,DNA,降解，从而,影响样品中目的基因的含量。,对于大量的样品最佳的检测方案是：,根据实际情况安排好每天要提取的样品数量，提取后若是,RAN,立即进行反转录反,应，并且将当天反转录的样品进行定量,PCR,检测；千万不可先将所有的样品都提取,RNA,，提取完,RNA,后再统一反转录，然后在对,cDNA,样品进行定量检测，千万不要这样做，因为,RNA,是极不稳定的，哪怕是存放于,-80,度冰箱，一方面,RNA,极其容易降解从而影响检测的准确性，另一方面万一实验室的超低温冰箱放生故障造成停机或停电，那所有提取的,RNA,将会很大程度的降解，对样品造成不可挽回的损失！,最好的安排是：当天提取或反转录的样品，当天就进行定量,PCR,的检测，最大程度的减少,RNA,的降解，这样测定的结果才更准确。,二、操作及结果分析,2,、定量,PCR,引物及探针的合成,定量,PCR,所扩增的片段长度一般都不超过,300bp,，这样才能确保结果更准确；染料法对引物的特异性要求较高，探针法对引物的特异性要求不高，探针法所扩增的片段长度更短，一般都在,200bp,以下。引物和探针都要进行,Blast,分析，以避免非特异性扩增。,二、操作及结果分析,3,、标准品的制备,-,质粒或纯化后的,PCR,产物,这一步骤一般在预实验时完成，严格意义上的操作要求将,PCR,产物切胶后进行胶回收，并进行质粒的连接、转化到感受态大肠杆菌中，质粒在大肠杆菌中增值后提取质粒，并用分光光度计测定含有,PCR,产物的质粒的,OD,值，借此来确定质粒的摩尔量，将已知摩尔量的质粒做,5,倍或,10,倍的连续梯度稀释，做成质粒标准品，这是准确测定样品中目的基因模板量的定量基础。,现在也有的不做质粒，直接测定纯化后的,PCR,产物的摩尔量，然后梯度稀释,PCR,产物，以此来作为标准品。,一般做四个标准品左右,5-25-125-625-3125,10-100-1000-10000-100000,二、操作及结果分析,4,、通道的选择及增益的选择,对于任何一款荧光定量,PCR,仪来说，都有一组或几组激发光和滤光片以及相应的检测器和滤光片，这些就构成了定量,PCR,仪的通道。不同的发光基团都有相应的激发光和相应的检测器。定量,PCR,仪从最初的单通道发展到现在的多通道，常用的通道有,FAM/HEX/JOE,等。可根据自己所用的发光基团来选择相应的通道。,增益（,gain,），是荧光信号的放大倍数，发光基团的荧光是很微弱的，必须经过适量的信号放大才能被检测，否则，整个扩增曲线的荧光强度非常小，以致无法准确检测。所以在实验前，要选择合适的增益倍数。,二、操作及结果分析,5,、标准曲线的建立,梯度稀释后，标准品的扩增曲线间距相等，标准曲线上的间距也相等，,说明标准曲线建立的很成功，假如间距参差不齐，说明梯度稀释时操作,误差太大，建议重新做标准品的梯度稀释，重新做标准曲线，直到扩增,曲线之间的间距相等为止。因为这一步直接影响着样品中目的基因,原始模板量的准确性。,二、操作及结果分析,6,、加样时的操作,所有的加样操作要围绕着尽量使反应体系均一化为目的，除了样品外，其他试剂都要进行预混，预混后分装到各个,PCR,管中，最后加样品，移液器要尽量准确，因为这一步的操作可以说是差之毫厘，谬以千里。,二、操作及结果分析,7,、阈值的设定,定量,PCR,反应结束时开始对结果进行分析