《动物细胞工程》课件

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,2.2,动物细胞工程,细胞工程的基本技术,植物,细胞工程,动物,细胞工程,植物组织培养技术,植物体细胞杂交技术,动物细胞核移植技术,动物细胞融合技术,单克隆抗体技术,动物细胞培养技术,(,基础),从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,一、动物细胞培养,1,、动物细胞培养的概念,动物细胞培养技术,动物细胞培养技术,思 考,1、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？,2、为什么动物细胞培养过程需将组织分散成单个细胞？,3、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？,4、如何理解原代培养和传代培养？,5、传代培养的细胞能一直传代下去吗？为什么？,6、动物细胞培养需满足哪些条件？,7、动物细胞培养有哪些应用？,动物细胞培养过程,1,、选材：,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。,2.,将组织细胞分散成单个细胞,将组织块剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间，这样组织就会分三成单个细胞。,思考：为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,单个细胞容易和周围环境进行物质交换,获得营养物质、氧气等，排出代谢废物；,分散成单个细胞培养能使细胞水平操作的其他技术得以实现,。,1.,进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？,P44,旁栏,用胰蛋白酶分散细胞,，,说明,细胞间的物质主要是蛋白质。,不能用胃蛋白代替,因为两者的最适,pH,不同，动物细胞培养适宜的,pH,为,7.2,7.4,，此环境下胃蛋白酶（,最适,pH,2.0,）没有活性，而胰蛋白酶,(,最适,pH,7.2-8.4),的活性较高。,胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？,P44,寻根问底,胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此,必须控制好胰蛋白酶的消化时间,。,动物组织,单个细胞,细胞悬液,贴壁生长,分瓶培养,10,代细胞,50,代细胞,不死细胞,原代培养,传代培养,胰蛋白酶,剪碎,加培养液,接触抑制,少数癌变,少数,3.,配制细胞悬液，进行原代培养及传代培养,1,、细胞贴壁：,悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，,称为细胞贴壁。,要求：,培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。,2,、细胞的接触抑制：,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制,。,细胞悬浮液,10,代细胞,50,代细胞,无限传代,原代培养,传代培养,4.,如何界定原代培养和传代培养？,随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖,原代培养,:,将动物组织消化后的初次培养。,传代培养,:,对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继续培养。,传代培养,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,胰蛋白酶,（分解弹性纤维）,10,代细胞,原代培养,50,代细胞,细胞株,无限传代,细胞系,遗传物质未改变,遗传物质改变,动物细胞培养过程,多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：,1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？,2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？,P46,讨 论,充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等合成成分及血清、血浆等天然成分。）,适宜温度、,PH,和气体环境；无菌无毒环境,4,、动物细胞培养的条件,（抗生素，更换培养液）,无菌、无毒,营养：与体内基本相同,温度和,PH,气体环境,（95%,空气 + 5%,CO,2,）,（36.50.5,， 7.2-7.4）,（合成培养基）,1,、大规模的生产生物制品。,2,、培养的动物细胞作为基因工程的受体细胞。,3,、检测判断物质的毒性。,4,、培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，如用于,等，为,及其他疾病提供理论依据。,5.,动物细胞培养,应用：,筛选抗癌药物,治疗和预防癌症,植物组织培养和动物细胞培养的比较,比较项目,植物组织培养,动物细胞培养,原理,细胞的全能性,细胞增殖,培养基性质,固体培养基,液体培养基,培养基特有成分,蔗糖,植物激素,葡萄糖,动物血清,培养结果,植物体,细胞,培养目的,快速繁殖、,培育无病毒植株,获得细胞,或细胞分泌蛋白,二,.动物细胞,核移植技术和克隆动物,将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体,（克隆动物）,。,分,类,胚胎细胞核移植,：,体细胞核移植,：,细胞分化程度低，恢复全能性容易；,细胞分化程度,高，恢复全能性不容易,1.动物细胞,核移植概念：,（,难度高,）,(,二,),、体细胞核移植的过程：,请看教材,P48,图,2-21,思考：,1.,核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细胞作为受体细胞有什么好处？,2.,通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？,M,中期卵母细胞,诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成,细胞分裂和发育进程。,卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体现全能性的物质。,电激处理使供体核进入受体卵母细胞构建重组胚胎,卵母细胞采集、培养,M,期,卵母细胞,供体牛,供体细胞注入去核卵母细胞,代孕母牛,克隆牛,体细胞培养,去核卵母细胞,去核,胚胎,移植,体细胞核移植过程（体细胞克隆动物）,、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。,、用于核移植的供体细胞一般都选用传代,10,代以内的细胞，为什么？,10,代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变,思考题,3,、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了,100%,的复制吗？为什么？,不是，克隆动物绝大部分,DNA,来自供体细胞核，但核外还有少部分,DNA,（如线粒体,DNA,）来自受体卵母细胞,思考题,1996,年，英国人,Ian Wilmut,成功获得,体细胞克隆羊,“,多利,”,，,这是世界上,第一例利用成年体细胞核获得的克隆动物,.,277,次乳腺细胞核移植实验；,获得,29,个发育为,8,细胞的,“,胚,”,；,13,头代孕母亲；,1996,年,7,月,5,日，羊羔,6LL3,，被命名为,“,多莉,”,。,多莉羊的培育过程,“,多莉羊,”,是雄还是雌？,是否符合孟德尔遗传？,问题,卵细胞,C,母绵羊子宫,母绵羊,母绵羊,乳腺细胞,卵细胞质,细胞核,细胞核移植,胚胎移植,早期胚胎,多莉羊,分娩,卵裂,融合后的卵细胞,妊娠,3.,体细胞核移植技术的应用前景：,1.,加速家畜遗传改良的进程,2.,保护濒危物种,3.,生产医用蛋白质及组织器官的移植,4.,了解胚胎发育和衰老过程；,追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病,3,、体细胞核移植技术存在的问题,P50,（,1,）成功率非常低,（,2,）克隆动物以表现早衰、生理缺陷等健康问题,成功率低，绝大多数克隆动物存在健康问题并表现出遗传和生理缺陷：如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。,思考与探究,1.,幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？,细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。,所以，,一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。,同样，,组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养,。,思考与探究,2.,动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？,动物细胞培养,不需,经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力,要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用,定向诱导动物干细胞,，使其分化成所需要的组织或器官。,3.1997,年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头,名叫卢辛达（,Lucinda,）的奶牛，年产奶量为,30.8 t,，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目,前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般,为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为,3,4 t,。,（,1,）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。,可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。,（,2,）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？,从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。,4.,体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。,研究方面,：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。,应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。,知识拓展,2,.,为什么动物细胞要分散成单个细胞培养？用酶消化的是什么物质？,细胞原代培养时可以分散成单个细胞培养，也可以用细胞群（团）、组织块培养，经传代培养后，最终都为细胞培养。,分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。,用酶消化的是细胞间基质，细胞间基质主要成分有胶原蛋白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性蛋白等成分。用蛋白酶可使其消化，从而使细胞相互分离。,知识拓展,3,.,体细胞核移植技术为什么要选择,M,期的卵母细胞做受体细胞？,细胞核移植技术中能用作受体细胞的通常有,M,期卵母细胞和受精卵（合子）。早期核移植技术中常用受精卵，后来基本上用,M,期卵母细胞取代了受精卵，主要因为两者的细胞质环境不同。有人认为重组需要的因子存在于,M,期卵母细胞的胞质中，而在原核形成时这些因子已被降解或用光，因此，原核扩张后受精卵去核可引起胞质中重组因子缺乏。成熟促进因子（,MPF,）是卵母细胞细胞质中重要的胞质影响因子，,MPF,的活性在卵母细胞减数分裂的,MI,期和,M,期达到最高，受精或激活后，,MPF,迅速灭活，因此，,M,期卵母细胞中,MPF,活性高，而受精卵中,MPF,活性低。,MPF,水平的高低可影响供体核染色质的状态和复制。,M,期卵母细胞细胞核、细胞质已成熟，而,MI,卵母细胞细胞核、细胞质尚未成熟，其细胞质不能支持胚胎的全程发育，因此，尽管,MI,期卵母细胞,MPF,活性也高，但不能用作受体卵母细胞。,也有人认为用去核合子做受体时，可能由于合子去核时一些早期发育必需的因子随原核的去除而被去掉了，而使去核受精卵缺乏发育能力。因此，目前广泛采用,M,期卵母细胞做受体。,