实验十PEG法诱导鸡血细胞融合

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验 十,PEG法诱导鸡血细胞融合,College of Life Science and Technology,XINJIANG Univercity,一、实验目的,了,解聚乙二醇（PEG）,诱导体外细胞融合的基本原理。,通过,PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验,，初步掌握细胞融合的基本方法。,二、实验原理,细胞融合（cell fusion）,又称,体细胞杂交,，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞（hybrid cell）。,细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。依据融合过程采用的,助融剂,的不同，细胞融合可分为：,病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒(hemagglutinating virus of Japan,HVJ);,化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）,;,电场诱导的细胞融合；激光诱导的细胞融合。,聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞,接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于,两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此,的表面张力作用，使细胞发生融合。,细胞融合的频率和活力与所用,PEG,分子质量、浓度、,作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。,骨髓间质充质干细胞移植后的细胞融合,荧光标记的细胞融合,三实验仪器、材料和试剂,仪器、用具：注射器、刻度离心管、离心机、血细胞记数板、水浴锅、滴管、显微镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、酒精灯等。,材料：成年家鸡。,（1）0.85%NaCl溶液:,（2）GKN液：,8.0gNaCl，0.4g KCl,1.77 g Na2HPO42H2O，,0.69 g NaH2PO4H2O，2.0g葡萄糖，0.01g酚红，溶于,1000ml重蒸水中。,（3）50%（m/v）PEG溶液：,取50gPEG(相对分子量=4000)放,入100ml瓶中，高压灭菌20min。让PEG 冷却至50-60，,勿让其凝固。加入50ml预热至50的GKN 液，混匀，置,37备用。,（4）,Hanks原液(10)：NaCl 80.0g；Na,2,HPO,4,12H,2,O1.2g；,KCl 4.0g；KH,2,PO,4,0.6g；MgSO,4,7H,2,O 2.0g；,葡萄糖 10.0g；CaCl,2,1.4g。,试剂,称取1.4g的CaCl2，融于30-50ml的重蒸水中。取,1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水800ml于烧,杯中，然后按上述配方顺序，逐一称取药品。必须在前,一药品完全溶解后，方可加入下一药品，直到葡萄糖完,全溶解后，再将已溶解的CaCl,2,溶液加入，最后加水至,1000ml。,（6）Hanks液：,Hanks原液100 ml，加重蒸水896 ml，,加0.5%酚红 4 ml。配好的Hanks液，分装包扎好,贴上标签，经过灭菌后，4保存。,（7）詹纳斯绿染液。,（一）鸡血细胞的体外融合,1.鸡血细胞的获得,用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血，注入试管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制成抗凝全血。,2.鸡血细胞储备液的制备,在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85%NaCl溶液，制成红细胞储备液，置于4冰箱内可供一周内使用。,3、鸡血细胞悬液的制备,取细胞悬液1mL，加4mL0.85%NaCl溶液混匀，1200r/min离心5min，弃上清液，再加入5ml 0.85%NaCl溶液按上述条件离心两次（5分钟，10分钟,）。,最后，弃去上清液，加入10ml的GKN溶液，制成鸡血细胞悬液。吸取0.5ml鸡血细胞悬液，加入4.5ml的GKN液进行稀释。,四、方法与步骤,吸,取悬液1mL放入离心管中，加入4mLHanks液混匀，1000r/min离心5min，弃上清液，再加入适量GKN液，使成10%的悬液。,4、PEG诱导细胞融合,吸取0.5ml 37的50%PEG溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在37水浴中静置5-10min。,5、染色和镜检,吸取细胞悬液，在凹面玻片上滴一滴，加入詹纳斯绿染液混匀，染色5min后盖上盖玻片，在显微镜下进行观察细胞融合情况。,观察时注意不同程度的,融合现象,。通常分为五个阶段。两细胞膜接触，粘连；细胞膜形成穿孔；两细胞的细胞质连通；通道扩大，两细胞连成一体；细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。,6计算细胞融合率,细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已融合细胞）的细胞核总数之比，通常以百分比表示，而且要进行多个视野测定，再加以平均统计，更为准确。,细胞融合过程在形态上的变化,五、实验结果,六、注意事项,1.高压灭菌过的PEG 冷却至50-60时就加入预热至50的GKN 液，勿让其凝固。,2.严格控制PEG的作用时间，通常处理细胞12min。,3.终止PEG的作用时，缓慢加入5ml Hanks 液，轻轻吹打，以免融合的细胞分离或破裂。,1绘出典型的细胞融合过程图。,2计算细胞融合频率。,3,说明影响原生质体融合的因素,。,七、作业,本实验所用,PEG,融合方法不能直接用于未脱壁植物细胞的融,合，因为植物细胞具有细胞壁，,PEG,无法介导其细胞融合；,但是，如果将植物细胞进行脱壁处理后，则可使用,PEG,融合,方法进行融合实验。,影响原生质体融合的因素。,（,1,）首先是酶解条件：渗透压稳定剂,Ca,2+,、,Mg,2+,、蔗糖,可保持原生质体稳定利于再生；随着酶解时间的增加原生,质体的释放量增大；酶解浓度到达一定浓度后，原生质体,的再生率下降；再就是酶解温度。,（,2,）原生质体的脱壁是否完全会影响融合效果。有的原生质,体会很快再生细胞壁，因此在洗去酶液后，应立即进行融合,处理。（,3,）原生质体的悬浮状况也会影响融合，如果两亲本原生质,体密度相差较大，就难以混和均匀，接触机会减少，这时应,用离心方法强迫它们密集,