2 核酸分离与PCR

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,RNA,一、核酸的分离纯化,DNA,核酸包括,DNA,、,RNA,两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在；,真核生物的染色体,DNA,为双链线性分子；,原核生物的,“,染色体,”,、质粒及真核细胞器,DNA,为双链环状分子；,有些噬菌体,DNA,有时为单链环状分子；,病毒的,DNA,、,RNA,分子，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状及单链线状等。,核酸的存在形式：,DNA、RNA,和核苷酸都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。,DNA,钠盐在水中为10,g/L,，呈黏性胶体溶液。,RNA,钠盐在水中溶解度可达40,g/L。,核酸的理化性质,在酸性溶液中，,DNA、RNA,易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。,DNA,溶液的粘度很大，而,RNA,溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。,核酸提取的原理,:,1）破碎细胞；,2）去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子；,3）去除其它不需要的核酸分子；,4）沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质,细胞的破碎,:,机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法,化学试剂法：用,SDS,处理细胞；,酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。,(1)浓盐法,利用,RNP,和,DNP,在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。,1）用1,M,氯化钠提取,得到的,DNP,粘液;,2)与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化;,3)离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而,DNA,位于上层水相中;,4)用2倍体积95%乙醇可将,DNA,钠盐沉淀出来.,DNA,提取的几种方法,（2）阴离子去污剂法:,用,SDS,或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取,DNA。,由于细胞中,DNA,与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,而阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取,DNA,。,（3）,苯酚抽提法:,苯酚是蛋白变性剂,同时抑制了,DNase,活性。,用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与,DNA,连接键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而,DNA,溶于水相。,利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀,DNA。,此法的特点是使提取的,DNA,保持天然状态。,DNA,提取举例：,高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外分光光度计。,1,：基因组总,DNA,的大量提取,液氮研磨动植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在,RNA,酶作用下，降解,RNA,。,仪器：,细胞裂解液（,100mM,Tris-HCl,5mM EDTA 500mM,NaCl,1%SDS pH 7.5,）；,酚,/,氯仿,/,异戊醇,氯仿,/,异戊醇；无水乙醇；,70%,及无水乙醇；,3M,NaAC,（,pH5.2,）；,RNA,酶；,TAE,缓冲液,试剂：,动植物材料,10g(,鲜组织,)0.5g(,干冻组织,),液氮，研碎,10ml,裂解液,加入等体积酚,/,氯仿,/,异戊醇颠倒混匀,(55,消化，,每,10min,颠倒混匀一次,),离心,(12000 xg,10min),上清液加入等体积酚,/,氯仿,/,异戊醇颠倒混匀,步骤：,离心,(12000 xg,10min),上清液,2,倍体积无水乙醇,(0.1,体积,3MpH5,2,乙酸钠）,挑取絮状体或者离心得到沉淀,（,70%,冷乙醇洗涤,室温干燥）,适量,TE(,或水,),溶解，加入,10ulRNase,，,65,10-30,分复溶和除,RNA,.,仪器：,研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。,RNA,提取,1,、无,RNA,酶灭菌水：用将,高温烘烤,的玻璃瓶（,180 2,小时）装蒸馏水，然后加入,0.01%,的,DEPC,（体积,/,体积），处理过夜后高压灭菌。,2,、,75%,乙醇：用,DEPC,处理水配制,75%,乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。,试剂：,1.,将组织在液,N,中磨成粉末后，再以,50-100mg,组织加入,1ml,Trizol,液研磨，注意样品总体积不能超过所用,Trizol,体积的,10%,。,操作步骤,(,Trizol,法,),：,Trizol,法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用,Trizol,法提取的总,RNA,绝无蛋白和,DNA,污染。,RNA,可直接用于,Northern,斑点分析，斑点杂交，,Poly(A,)+,分离，体外翻译，,RNase,封阻分析和分子克隆。,2.,研磨液室温放置,5,分钟，然后以每,1mlTrizol,液加入,0.5ml,的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管,15,秒。,3.,离心，取上清于一新的离心管，按每,mlTrizol,液加,0.5ml,异丙醇,的比例加入异丙醇，室温放置,10,分钟，,12000g,离心,10,分钟。,4.,弃去上清液，按每,ml,Trizol,液加入至少,1ml,的比例加入,75%,乙醇，涡旋混匀，,4,下,7500g,离心,5,分钟。,5,、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥,5-10,分钟，注意不要干燥过分，否则会降低,RNA,的溶解度。然后将,RNA,溶于水中，必要时可,55-60,水溶,10,分钟。,RNA,可进行,mRNA,分离，或贮存于,70%,乙醇并保存于,-70,。,注意,：,1.,整个操作要勤换一次性手套，并尽可能在低温下操 作。,2.,加氯仿前的匀浆液可在,-70,保存一个月以上，,RNA,沉淀在,70%,乙醇中可在,4,保存一周，,-20,保存一年。,二、,PCR,技术,由,1985,年穆里斯（,K.Mullis,）,发明，他也因此获得了,1993,年的诺贝尔化学奖。,PCR,，即,聚合酶链式反应,或多聚酶链反应（,Polymerase Chain Reaction,）,是一种对特定的,DNA,片段在体外进行快速扩增的新方法。,1.PCR,反应基本要素,引物,模板,dNTP,Mg2+,DNA,聚合酶,引物设计：,1,）来自水生栖热菌,Thermusaquaticus,；,2,）,良好的耐热性；,3,）,Mg2+,依赖性；,4,）无校正功能,Forward primer,Reversr,primer,Taq,polymerase:,2.PCR,基本原理,变性,95,C,延伸,72,C,退火,Tm-55,C,变性,1,复性,1,延伸,1,变性,2,复性,2,延伸,2,25,30,次循环后，模板,DNA,的含量可以扩大,100,万倍以上。,.,3.PCR,的类型,定量,PCR,反转录,PCR,（,RT-PCR,）,原位,PCR,巢式,PCR,AAAAAAAAAAAAAAA.,TTTTTTTTTTTTTTTT.,.,AAAAAAAAAAAAAAA.,TTTTTTTTTTTTTTTT.,.,cDNA(complementary,DNA),逆转录,AAAAAAAAAAAAAAA.,mRNA,引物锚定,cDNA,合成,PCR,扩增,RT-PCR,巢式,PCR,Cycle 1,第一轮,PCR,产物,第二轮,PCR,Cycle 2,定量,PCR,荧光,PCR,在,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个,PCR,进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,荧光标记基团在某波长的激发光刺激下，产生一个更长波长的发射光,荧光标记信号的产生,PCR,扩增时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；,PCR,扩增时，,Taq,酶的,5,3,外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条,DNA,链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与,PCR,产物形成完全同步。,荧光探针和荧光染料,TaqMan,荧光探针：,荧光标记方式：,在,PCR,反应体系中，加入过量,SYBR,荧光染料，,SYBR,荧光染料特异性地掺入,DNA,双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的,SYBR,染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与,PCR,产物增加完全同步。,SYBR,荧光染料：,Bio-,rad,iCycler,扩增曲线,扩增曲线,PE-5700,扩增曲线,PE-7700,扩增曲线,样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数,Ct,值,Ct,值,荧光,PCR,定量的原理,Unknown,未知样本拷贝数的确定,1),全封闭反应，无需,PCR,后处理,2),特异性强，灵敏度高,3),采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确,4),定量范围宽，可达到,10,个数量级,5),仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断,6),可实现一管双检或多检,7),操作安全，缩短时间，提高效率,8),利于自动化和联网管理,荧光,PCR,主要优点：,Rotor-Gene3000 Advanced,荧光实时定量,PCR,仪,Corbett Research,公司,ABI Prism 7300,型荧光定量,PCR,仪,（一）目的基因的克隆,（二）基因的体外突变,（三）,DNA,和,RNA,的微量分析,（四）,DNA,序列测定,（五）基因突变分析,4.PCR,的主要用途,