凝集素和免疫组化

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九章,.,凝集素组化和免疫组化,(,Lectin,Histochemistry,and,Immunohistochemistry,),一,.,凝集素简介,A.,是一类非免疫源性,能与糖结合的蛋白质或糖蛋白,来源广泛,易于提取,.,B.,可用荧光素,酶,生物素和胶体金等标记,.,C.,虽不是抗体,但却可以,特异性地,与糖基结合,从而区分细胞亚群和与糖表达有关的细胞行为,.,1,凝集素 来源 亚基数 单糖特异性,Con A,刀豆,4,甘露糖,WGA,麦芽,2 N-,乙酰葡糖胺,BSA-I,西非单叶豆,4,半乳糖,DBA,双花扁豆,4 N-,乙酰半乳糖,PHA,菜豆,4 N-,乙酰半乳糖,UEA-I,荆豆？岩藻糖,PNA,花生,4,半乳糖,RCA-I,蓖麻,4,半乳糖,2,D.,特性,:,1.,结构,:,218,亚基聚合体,.,2.,糖基,-,凝集素复合物,:,a.,多价,:,每个亚基至少有一个结合位点,可结合多个单糖,.,b.pH,依赖性,:,酸性,pH,可使凝集素分解成亚基或单体,.,c.,受离子影响,:,Ca,2+,Mg,2+,和,Mn,2+,等可保持其结合活性,.,d.,可逆,:,特定的单糖使复合物分离,.,单糖解聚凝集素,-,糖复合物,.,3,二,.,基本原理与条件,A.,基本原理,:,凝集素特异性结合于组织后,通过组化或免疫组化使凝集素在镜下可见,.,1.,直接法,:,将凝集素用荧光物质,酶或胶体金标记后,直接作用于组织,.,2.,抗体法,:,凝集素不标记,结合于组织后添加抗凝集素抗体,.,该抗体可为标记抗体,.,若为非标记抗体,再继续用标记二抗或,PAP,法完成染色,.,3.,生物素法,:,用生物素标记凝集素后,作用于组织,再用标记的抗生物素蛋白或,ABC,复合物与生物素作用,.,4.,糖,-,凝集素,-,糖夹层法,:,形成组织中的糖,-,凝集素,-,糖基化标记物,.,4,B.,条件,:,1.,组织制备,:,新鲜,未经处理的组织最理想,.,2.,暴露糖基,:,蛋白水解酶消化切片,增加检出机会,.,3.,加入蛋白质,:,加入不含糖基的蛋白质如,0.110%,牛血清白蛋白,(BSA),可以使凝集素稳定,并减弱非特异性染色,.,4.,缓冲液,:,TBS,pH 7.4,常加入少量多种,2,价金属离子：,Tris,6.08g,NaCl,8.7g,DDH,2,O,加至,100ml,并用,HCl,调,pH,至,7.4,再加入,1%CaCl,2,1.5ml,1%MnCl,2,2ml,1%MgCl,2,2ml(,后三者的终浓度为,1mM),5,四,.,直接法,A.,原理,:,将,FITC,HRP,或胶体金标记的凝集素直接用于组织,.,B.,方法,:,1.,冰冻切片,空气干燥,(,经或不经丙酮或甲醇固定,);,或石蜡切片,脱蜡至水,.,缓冲液洗,.,2.,100,g/ml,标记凝集素,室温,30,分,.,缓冲液洗,.,3.,封片,荧光,(FITC),或普通,LM(,胶体金,),观察,;,或,0.05%DAB-0.01%H,2,O,2,显色,(HRP).,4.,脱水,透明,封片,.,6,胃壁细胞,EM,观察,HRP,标记的双花扁豆凝集素,(DBA),染色,7,五,.,抗体法,A.,原理,:,将组织切片孵育于凝集素溶液,使之结合于切片上的糖链,清洗后加凝集素的特异性抗体,.,该抗体可用,FITC,HRP,或胶体金标记,;,也可不标记凝集素抗体,而将二抗标记,;,或使用未标记二抗,再用,PAP,复合物完成染色,.,8,B.,方法,:,1.,标记一体法,:,a.,石蜡切片,脱蜡至水,.,b.,3%H,2,O,2,10,分,抑制内源性酶,(,针对酶标记,).,缓冲液洗,.,c.,10,g/ml,未标记的凝集素,室温,30,分,.,缓冲液洗,.,d.,1:100(,抗血清,),或,10,g/ml,(IgG),标记的抗凝集素抗体,30,分,.,缓冲液洗如上,.,e,.,镜检或,0.05%DAB-0.01%H,2,O,2,显色后镜检,.,9,2.,标记二抗法,:,a.,前,5,步同,1.,b.,未标记的凝集素抗体,1:100,或,10,g/ml,30,分,.,缓冲液洗,.,c.,标记的二抗,1:50100,30,分,.,缓冲液洗,.,d.,镜检或,DAB-H,2,O,2,显色后镜检,.,3.PAP,法,:,a.,前,7,步同,2.,b.,未标记的二抗,1:50100,30,分,.,缓冲液洗,.,c.,PAP,复合物,1:50100,30,分,.,缓冲液洗,.,d.,0.05%DAB-0.01%H,2,O,2,显色,后镜检,.,10,六,.,生物素法,:,A.,原理,:,将凝集素用生物素标记,作用于组织切片上的糖基,然后加用标记的抗生物素蛋白,或,ABC,复合物,使之与生物素结合,从而将标记物引入到凝集素结合的组织部位,.,11,B.,方法,:,1.,石蜡切片,脱蜡至水,.,2.,0.1%,胰蛋白酶,(,含,0.1%CaCl,2,),37,1030,分,.,缓冲液洗,.,3.,3%H,2,O,2,10,分,封闭内源性酶,.,缓冲液洗,.,4.,生物素标记的凝集素,210,g/ml,3060,分,.,缓冲液洗,.,5.,标记抗生物素蛋白,110,g/ml,30,分,;,或,ABC,复合物,3060,分,.,缓冲液洗,.,6.,荧光显微镜观察,(,荧光标记,),或,0.05%DAB-0.01%H,2,O,2,显色后普通光镜观察,(,酶标或,ABC,复合物,).,12,胃壁细胞和上皮光镜观察 生物素标记的双花扁豆凝集素,(DBA),和蓖麻凝集素,(RCA),染色,13,七,.,糖,-,凝集素,-,糖夹层法,A.,原理,:,将过量凝集素加于组织切片上,(,以保证凝集素的结合位点被组织上的糖基,不完全,占据,),再加糖基化的标记物,(,如岩藻糖基,Fuc,-HRP),其中的糖基将结合于未被占据的凝集素结合位点,然后显示标记物,.,由于目前发现的糖基化的标记物种类不多,故夹层法的使用有限,.,14,糖基化,HRP,的凝集素结合特性,糖基化,HRP,糖基 凝集素,HRP(,未处理,)Man,Con A,LCA,PSA,半乳糖基,-HRP Gal PNA,SBA,RCA,岩藻糖基,-HRP,Fuc,UEA-I,LTA,甲壳乙糖基,-HRP,Glc,NAc,WGA,UEA-II,B.,方法,:,1.,石蜡切片脱蜡至水,.,2.,3%H,2,O,2,10,分,封闭内源性酶,(,针对酶标记,).,缓冲液洗,.,3.,1020,g/ml,凝集素,如,ConA30,分,缓冲液洗,.,4.,20,g/ml,糖基化标志物如,Fuc,-HRP,3060,分,.,缓冲液洗,.,5.,显示标记物,(,例如用,0.05%DAB-0.01%H,2,O,2,显示,HRP,活性,).,15,八,.EM,凝集素法,:,在,EM,中常用,HRP,和胶体金作为标记物,.,包埋前染色显示,细胞表面,包埋后染色显示,细胞内,的糖结合物,.,A.,包埋前染色,:,1.,直接法,:,a.,细胞悬浮固定于,2.5%,多聚甲醛中,4,小时,.,离心细胞,缓冲液洗,.,b.,0.2M,甘氨酸,-TBS,洗,15,分,.,离心细胞,缓冲液洗,.,c.,金标凝集素,10,g/ml,室温,12,小时,.,离心细胞,缓冲液洗,.,d.,包埋,超薄切片,.,2.,间接法,:,细胞经预处理后,以未标记凝集素,(10g/ml),处理,然后以该凝集素的特异性抗体和金标蛋白,A,相继处理,;,或用糖,-,凝集素,-,糖夹层法,;,也可用生物素标记凝集素加于细胞,再用金标抗生物素蛋白处理,.,16,B.,包埋后染色,:,以直接法为例,.,1.,细胞或组织固定于,2%,戊二醛过夜,.,2.,常规或低温包埋,超薄切片,.,3.,将载有切片的镍网漂浮于,1,滴,0.05mM NH,4,Cl,溶液上,15,分,.,缓冲液洗,.,4.,TBS-BSA,处理,.,5.,将镍网置,1,滴金标凝集素溶液上,(10,g/ml,),12,小时,室温,.,6.,双蒸水喷洗,干燥后铀,-,铅染色,观察,.,17,九,.,对照试验,A.,阳性对照,:,证明凝集素及所用各种染色试剂和染色方法都是有效的,.,1.,凝集素凝集对照,:,大多数凝集素都能与红细胞结合,(,与血型物质特异性结合或非特异性结合,.,2.,组织对照,:,组织切片上的红细胞和血管内皮细胞常被各种凝集素染色,.,18,B.,阴性对照,:,检查染色的特异性和单糖特异性,.,前者指染色是否由凝集素引起,后者指染色是否由某单糖,(,或含某单糖的寡糖,),所引起,.,1.,在直接法中,使用标记凝集素之前,以过量未标记凝集素,(1mg/ml,30,分,),封闭组织中的结合位点,.,2.,在间接法中,从染色程序中省去凝集素,.,3.,在糖,-,凝集素,-,糖夹层法中,在凝集素与标记糖蛋白之间加用未标记糖蛋白,.,4.,预先将凝集素,(,间接法,),或标记凝集素,(,直接法,),稀释在,0.10.2mM,抑制性单糖溶液冲,孵育,30,分,然后用于染色,.,由于凝集素已与特异性单糖结合,将不会出现阳性染色,.,以无关的单糖溶液稀释凝集素或标记凝集素,用以染相邻切片,应不影响染色结果,.,5.,将切片用特异性糖苷酶消化,以除去末端糖基,将使特异性凝集素结合变为阴性,.,19,