体内药物分析第七章免疫分析法课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第七章 免疫分析法,10/6/2024,1,【大纲要求】,1、熟悉免疫分析法的基础知识,2、了解放射免疫分析法、酶免疫分析法、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法,10/6/2024,2,第一节：概 述,基本原理,基本条件,方法分类,10/6/2024,3,免疫分析法(Immunoassay，IA)：是指以特异性抗原抗体反应为基础的分析方法。,1959年，由美国Yallow和Berson等人将放射性同位素示踪技术的高灵敏性和免疫反应的高特异性结合起来，首先测定了糖尿病人血浆中的胰岛素含量，从而创立了放射免疫分析方法(Radioimmunoassay，RIA)。,酶免疫分析法、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法、时间分辩免疫分析方法等,。,10/6/2024,4,一、基本原理,(一)竞争抑制原理,实质都是抗原一抗体竞争结合反应,Ag*：标记抗原 Ag：未标记抗原,Ab：特异抗体,Ag*Ab：标记抗原抗体结合物， AgAb代表未标记抗原一抗体结物,K：平衡常数(K=K,1,/K,2,)。,10/6/2024,5,抗原抗体反应须满足以下条件：,Ag*,与,Ag(,待测物,),必须是相同的生物活性物质；,所加入,Ag*,和,Ab,的量应是固定的；,Ag*,与,Ag,的量之和应大于,Ab,的结合位点；,Ag*,、,Ag,及,Ab,须处在同一反应体系中。,10/6/2024,6,这种竞争抑制的数量关系成为免疫分析的定量基础,10/6/2024,7,(二)竞争抑制曲线(剂量反应曲线),用待测物的标准品配置一系列已知浓度的标准溶液，再加入一定量的标记抗原和抗体，待抗原抗体反应达到平衡后，测定系列标准溶液的Ag*Ab的结合率。,B代表结合的标记抗原；,F代表游离的标记抗原；,T代表总的标记抗原。,10/6/2024,8,B/F-Ag,B/(B+F),100%,-Ag,10/6/2024,9,(三)抗原一抗体反应的特点,1特异性,一种抗原分子只能与由它刺激产生的抗体发生特异性结合反应。,抗原的特异性主要取决于,抗原决定簇(Cluster)的数量、性质及立体构型。,抗体的特异性则取决于,抗原结合段(fragment of antigen binding，Ig,Fab,)与相应抗原决定簇的结合能力,。,交叉反应(cross reaction)：结构相近似的其它药物或化合物与抗体的结合。,10/6/2024,10,2可逆性,抗原与抗体的特异性结合是由于两者的,分子结构及立体构型相互吻合,，它仅发生在分子的表面，并依靠抗原一抗体分子间的静电力作用、疏水作用、氢键作用及范德华引力等而存在。,是可逆反应，改变反应条件可使结合物发生水解。,10/6/2024,11,3最适比例性,抗原抗体的结合反应具有一定的量比关系。只有当抗原抗体两者的分子比例合适时，才能发生最强的结合反应。,以沉淀免疫反应为例,10/6/2024,12,二、基本条件,三种基本试剂：,标记抗原、未标记抗原和特异抗体,(一)抗原及其制备,1全抗原与半抗原,抗原(Antigen)：能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质。,物质的抗原性包括,免疫原性和抗原特异性,。,免疫原性(Immunogenicity)：抗原注入动物体内后能促使动物产生特异抗体。,抗原特异性(Antigenic Specifiety)：抗原能与特异抗体相作用的性质。,10/6/2024,13,1全抗原与半抗原,全抗原,：同时具有免疫原性和抗原特异性的物质。,半抗原,(Hapten)：只能与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质。,人工完全抗原,：药物(半抗原) 本身不具免疫原性，只有当它们与某些大分子的载体物质(如蛋白质或多肽)共价结合后，才具有免疫原性。这种小分子半抗原和大分子载体物质结合后所形成的全抗原。,10/6/2024,14,2人工抗原的制备,(1) 载体(carrier)的选择：作为载体应考虑药物与载体结合后其免疫活性是否高、溶解度是否大、对化学反应合有机溶剂导致的变形作用有足够的抵抗力、价廉易得,载体的本质是蛋白质动物血清蛋白最常用。,牛血清白蛋白(BSA)、 兔血清白蛋白(RSA)、人血清白蛋白(HSA),(2) 半抗原的选择,药物本身必须具有合适的活性官能团，如-COOH，NH,2,，OH，CO等。,10/6/2024,15,(3)载体与半抗原的结合, 碳二亚胺法,利用碳二亚胺为缩合剂，将药物分子中的羧基与蛋白质分子中的氨基相连形成肽键,10/6/2024,16, 混合酸酐法,10/6/2024,17, 戊二醛法, 琥珀酸酐法,10/6/2024,18, 重氮化的对氨基苯甲酸法,10/6/2024,19,3人工抗原的鉴定,鉴定的目的：测定人工抗原（药物）与蛋白质的结合比,光谱分析法,化学分析法,放射性同位素法,10/6/2024,20,(1)光谱分析法,结合物水解后，光谱法测定水解药物和蛋白质的含量，从而推算出它们的分子结合比。,(2)化学分析法,利用,三硝基苯磺酸钠或二硝基酚,，测定蛋白质与半抗原结合前后游离氨基数目的差别。反应出蛋白质与药物的结合程度，可求出结合物中药物的含量。,(3)放射性同位素标记法,在制备人工抗原时，在已知量的药物中加入定量的放射性同位素标记药物，然后通过测定结合物中的放射性强度，便可计算出加入的标记药物的总量中已与蛋白质结合的比例。,10/6/2024,21,4标准抗原(,Standard antigen,),标准抗原:在免疫测定中用来制作标准曲线或制备标记抗原用的药物标准品，是免疫分析的定量依据。,蛋白质、多肽类可使用纯度较低的产品，但一般不应低于90，尤其是其中不能含有化学结构相类似的干扰杂质，否则会使样品的测定结果偏高。,10/6/2024,22,(二)特异抗体的制备及鉴定,1特异抗体(Specific Antibody),特异抗体:（高度特异性）是指抗原(免疫原)作用于机体产生免疫反应，在血清中产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。,在免疫球蛋白中，免疫球蛋白G (IgG)含量最高(约占70)，是免疫分析中最常用的抗体。,10/6/2024,23,2抗体的制备,单克隆抗体,(Monoclonal Antibody，McAb,)： 将预先免疫过的小鼠脾细胞与体外培养的骨髓瘤细胞，经细胞融合技术而得到的杂交瘤细胞。该瘤细胞通过体外培养，可大量复制，产生出特异的结构相同的均质抗体，此即单克隆抗体。,多克隆抗体(,Polyclonal Antibody,)的制备是将抗原直接免疫动物而得到。,抗体：单克隆抗体和多克隆抗体(抗血清)两大类,10/6/2024,24,(1)免疫原的制备,免疫原(Immunogen)：,人工将抗原制成能刺激机体引起体液及细胞免疫反应的物质。,水剂：,抗原中加入一定量的无菌生理盐水所制成的免疫原。,福氏完全佐剂(,Freunds Complete Adjuvant,),：,其制法是：取羊毛脂一石蜡油(1：3)混合，高压灭菌，等体积地与一定浓度的抗原混合，按3 mg/ml的量加入卡介苗，研磨或于无菌注射器中对拉，使之成为油包水的程度(放入冰水中不扩散)即可。,福氏不完全佐剂,在福氏完全佐剂中去掉卡介苗。,10/6/2024,25,(2)免疫接种动物,家兔,不仅对抗原的免疫反应较好，而且产生的抗体也较均一，是首选的免疫动物。,羊、豚鼠,微量免疫法的免疫抗原量在微克级内，常量免疫法的免疫抗原量通常在110 mg左右，大量免疫法的免疫抗原量在50100 mg。,10/6/2024,26,(3)抗血清的获得,采血时应注意,无菌操作,，尽可能将血放人面积较大的无菌容器中，先室温凝固30min左右，再放人30温箱约2h使凝固，最后放入4冰箱过夜。次日吸取血清，将血块用无菌的玻璃棒轻轻拨离并捣碎，在400010000 r/min离心20min，即得抗血清。,大动物免疫,羊,部分采血,家兔,等小动物杀死动物一次性放血。,10/6/2024,27,3抗体的鉴定,(1)滴度(Titer),滴度又称,效价或工作稀释度,。滴度用免疫反应液中抗体(实指,抗血清,)的稀释度表示，稀释倍数越大，表示滴度越高。,测定滴度可采用,标记抗原法,。,RIA法测定抗血清的效价为例,首先将抗血清用空白血清按比例稀释，然后精密吸取各稀释抗血清等量，分置若干支试管中，再于各试管中分别加入定量的放射性同位素标记药物(,设放射性强度为T,)，温育。待反应达到平衡后，于反应液中加人分离剂(如沉淀剂)，分离与抗体结合的标记药物(沉淀部分)，测定各管中,沉淀的放射性强度(B),，并计算各管中,标记药物的结合百分率(B/T),。,10/6/2024,28,当抗血清稀释度足够低时，其结合率趋于极值，该值称为“,过量抗体结合率,”(标记药物全被结合)，如图中曲线的,AB,段，可用来衡量标记药物的质量。自AB段以后，随着抗血清稀释倍数增大，其标记药物的结合率逐渐降低，实际工作中多采用结合率为50时(,C点,)的抗血清稀释度(,D点,)。,10/6/2024,29,(2)活度(,Avidity,),活度：抗体与相应抗原的亲和力(,Affinity,)。,活度可反映出抗体分子和抗原分子之间的结合能力。活度高，表明形成抗原一抗体结合物的速度快而解离小。抗体活度高低与免疫分析方法的灵敏度密切相关，它主要表现在剂量反应曲线的斜率上，斜率越陡，表明活度越高，测定效果越好。,10/6/2024,30,(3)特异性(Specificity),特异性：抗原和抗体的结合能力与其它结构相类似的干扰物的结合能力的比较。,如果抗体与抗原的结合能力越强，而与其它类似结构的干扰物结合能力(称为交叉反应)越弱，则说明抗体的特异性越强。,10/6/2024,31,三、方法分类,1按标记物的种类分,(1)放射免疫分析,(radioimmunoassay，RIA),(2)酶免疫分析,(enzyme immunoassay，EIA),(3)化学发光酶免疫分析,(chemiluminescent enzyme immunoassay，CIZIA),(4)荧光免疫分析法,(fluorescence immunoassay，FIA),10/6/2024,32,荧光免疫分析法,底物标记荧光免疫分析,(,Substrate labeled fluorescence immunoassay，SLFM),荧光偏振免疫分析,(fluorescence polarization immunoassay，FPIA),荧光淬灭免疫分析,(Fluorescent Quenching Immunoassay，FQM),荧光增强免疫分析,(Fluorescent Enchancement Immunoassay，FEIA),时间分辨荧光免疫分析,(time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA),10/6/2024,33,2按是否加入分离剂分,(1)均相免疫分析(Itomogeneous lmmunoassay),在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，反应液中结合的标记药物与游离的标记药物之中有一种不产生信号或信号消失，因此无需将反应液分作两相，即可在均相溶液中进行测定，故称为均相免疫分析。如酶放大免疫测定技术(enzyme multiplied immunoassay technique，EMIT) 。,(2)非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay),在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，只有在反应液中加入分离剂，将游离标记药物和结合标记药物分开之后，才能测出各自部分的标记药物浓度。否则，测定的是两者的总浓度。由于这种信号的测定需将反应液分成液-固两相后，才能分别测定，故称为非均相免疫分析。如放射免疫测定(Radioimmunoassay，RIA),10/6/2024,34,第二节 放射免疫分析,放射性同位素标记抗原,F与B的分离技术,放射免疫测定仪,标准曲线的制备与样品测定步骤,方法评价,应用举例,10/6/2024,35,放射免疫分析(,Radioimmunoassay，RIA,)：,利用放射性同位素的测量方法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素分析技术。,特点：,灵敏度高、特异性强、样品用量少、标记物容易制备以及放射性强度容易检测,10/6/2024,36,一、放射性同位素标记抗原,在体内药物分析中，常采用放射性同位素。放射性同位素是指能自发放射出射线而变成其它元素的不稳定同位素。放射性同位素在发生核衰变时，会发射出-射线，-射线及-射线。用相关仪器检测产生的射线，即可用于于定量分析。,10/6/2024,37,1放射性强度,放射性强度(严格说应为放射性活度)：每秒钟放射性同位素的原子核发生的衰变数(,desintegration per-second，dps,)，其单位为贝可(Bq)。1贝可相当于每秒1次核衰变，即lBq=1dps。,1居里是指每秒钟放射性同位素发生3.710,10,次核衰变,。,10/6/2024,38,2放射性比度,放射性比度或称比放射性或比活性：放射性同位素单位重量或体积中所含的放射性强度。,mci,g,-1,或mciml,-1,10/6/2024,39,3放射性化学纯度,(放化纯度),放化纯度是指供使用的放射性药物中所需要的标记药物的放射性强度占总放射性强度的百分比。一般实验要求放化纯度大于90。,10/6/2024,40,(二)标记抗原(,Iabeled Antigen,),标记抗原又称放射性标记药物，供标记的药物通常应是待测药物的纯品。,标记抗原的纯度决定RIA的特异性,，,而标记抗原的放射性比度则决定RIA的灵敏度,。因此，标记抗原是RIA测定技术中最关键的成分。,10/6/2024,41,1对标记抗原的一般要求, 有高的放射性比度；, 标记后抗原仍具有原来的抗原性；,标记物稳定性要好，不致因辐射引起化合物分解。,10/6/2024,42,2标记放射性同位素的选择,125,I的特点是：,化学性质活泼，易于标记；,标记物在衰变中放出的射线能量较高，易于测定；,标记物的放射线半衰期相对较短，须经常标记；,碘原子的半径较大，标记后可改变药物的化学结构或掩盖药物分子的特异功能基团，易使药物分子的抗原性受到影响。,3,H的特点是：,用,3,H标记后的药物可获得较高的放射性比度；,标记后的药物的抗原性不会受到影响，因为氢原子的半径较小，且,3,H只是与药物分子的,1,H发生交换，不涉及化学元素的改变,3,H的半衰期很长，可达1216年；,3,H发射出的射线能量较低，须采用价格较贵的液体闪烁计数器才能测定其放射性强度。,10/6/2024,43,(三)标记方法,1,125,I标记抗原的制备,取代反应将其标记在药物或药物的衍生物上。,用碘标记时一般采用,氧化法,，常用的氧化剂有,H,2,O,2,及氯胺T等，目前应用最多的是氯胺T,。氧化法是指先用氧化剂将放射性碘离子(I,-,)氧化成游离的放射性碘分子(I,2,)，然后再进行标记。,大分子药物可直接采用放射性碘标记。,小分子物质一般先将药物制成含酪氨酸、组氨酸或含酚基的衍生物，然后再进行标记，使药物分子中的氢被带正电荷的放射性碘取代。,10/6/2024,44,2,3,H标记抗原的制备,H标记可分为,定位标记和非定位标记,两种方法。,非定位标记,通常采用气体曝射法，即将药物与氚(,3,H)气密封在一起，放置几天或几周，使,3,H与药物分子的,1,H发生交换,定位标记,采用特殊的合成路线，即先将,3,H引入药物分子结构中的指定位置，制成含有不饱和双键的标记药物前体，然后再对双键部位进行催化加氚。这种制备,3,H标记物的方法称为定位标记.,10/6/2024,45,10/6/2024,46,二、F与B的分离技术,游离的标记药物(F)和结合的标记药物(B),1、沉淀法,2、吸附法,3、固相法,4、双抗体法,10/6/2024,47,(一)沉淀法,用蛋白沉淀剂将抗体沉淀，从而可使与蛋白(抗体)相结合的药物也一起沉淀下来，而游离的药物由于未与蛋白结合，便留在于溶液中。,常用的沉淀剂：,硫酸铵、亚硫酸氢钠、乙醇、异丙醇,。,方法：在免疫反应达到平衡后的反应液中加入一定量的饱和硫酸铵溶液，使最终浓度为1.62.0mol/L (约4050的饱和度)，立即混匀，在4条件下反应2030min后，离心，分离沉淀物，用40的硫酸铵饱和溶液洗涤沉淀，然后测定放射性强度。,优点：快速、简便、价廉,。,缺点,：不能使F和B完全分离，沉淀物对放射性标记抗原有非特异性吸附，因而空白值较高。,10/6/2024,48,(二)吸附法,吸附法是利用固体吸附剂能在反应液中吸附游离抗原的原理而使F与B分离。,常用的吸附剂：,右旋糖酐包裹的活性炭(,Dextron Coated Carbon，DCC,)、纤维素、硅酸盐等。,10/6/2024,49,原理：,DCC是利用活性炭的强吸附性和右旋糖酐的分子筛作用，使小分子的游离药物能通过分子筛的网眼被内层的活性碳选择性吸附，而与抗体相结合的药物由于分子体积大则不能通过网眼而被留在液相中。,方法：,当免疫反应达到平衡后，于反应液中加入DCC吸附剂，待吸附达平衡后，离心。离心后的结果正好与沉淀法相反，上清液中是与抗体相结合的标记药物(B)，而沉淀中则是游离的标记药物(F)。,优点：快速、简便,缺点：如药物一抗体结合物的离解常数较高时，测定结果不稳定。,10/6/2024,50,(三)固相法,原理：,通过物理涂敷或化学结合方法将抗体结合在不溶性固相载体表面，待抗原与抗体形成结合物(B)后就附在固相物上，而游离的抗原(F)则仍留在反应液中，从而实行分离。,该法实质上是一种固相免疫测定法(,solid-phase immunoassay,)，其固相本身就是一些特异的免疫吸附剂。,常用的固相载体：葡聚糖凝胶、聚苯乙烯、纤维素、试管等。,10/6/2024,51,方法：,采用试管固相法，即将抗体直接附着于试管底部的内壁上，测定时于试管中加入样品和试剂，当放射免疫反应达到平衡后，结合物就附在管壁上，游离抗原则留在液相中。通过离心或采用简单倾去法便可将两相分离。,优点：简便、快速、实用。,缺点：有时难以获得重复的结合率，其次是固相载体本身也有可能吸附游离标记药物，导致结果误差增大。,10/6/2024,52,(四)双抗体法,分离原理：,药物(半抗原)与抗体结合后，虽然分子量增大，但还不足以生成沉淀而处于“溶解”状态，这种抗体通常被称为第一抗体，它可通过将抗原注入家兔、豚鼠等动物体内免疫获得。然后再将第一抗体作为新的抗原注入羊、马、牛等较大动物，则可免疫获得,第二抗体(抗一抗体),。当往第一抗体的反应液中加入第二抗体后，第一抗体能与第二抗体结合使分子量增大，从而生成沉淀。离心后与抗体结合的,标记药物(抗原-第一抗体-第二抗体结合物,)处在沉淀中，而游离的标记抗原则留在上清液中。,10/6/2024,53,优点：分离效果好，适用范围广。,缺点：抗体的制备有一定难度，且操作流程较长。,10/6/2024,54,三、放射免疫测定仪,一类是计数器(-Counter),，其所用的闪烁体是碘化钠等固态闪烁晶体，为提高其发光效率，还在晶体内加入有0.10.5的铊作为激活剂，该仪器适合测定,125,I、,131,I等同位素发射出的能量较高的-射线。,一类是液体闪烁测量仪(Liquid Scintillation Counter),，由于该仪器放出的射线能量低、射程短，不可能穿人和激发固态闪烁晶体，而只能在特定的闪烁液中进行，由-射线激发液体闪烁剂而产生闪光现象。该仪器适合测定,3,H、,14,c等同位素发射出来的-射线。,10/6/2024,55,(一)测量原理,液体闪烁测量仪是利用放射性同位素标记药物所发射出的,-射线能作用于闪烁液而发出荧光(闪光)，该荧光与放射性药物在单位时间内的核衰变次数有关，通过检测闪烁次数便可求出待测组分含量。,10/6/2024,56,1溶剂,作用：,溶解闪烁剂和放射性样品；同时还起着吸收和转移-射线能量的作用。,条件：,溶剂分子必须具有高度共轭的双键，只要受到能量低的-射线的辐射，其电子就能跃迁至激发态。,一类是,烷基苯类，甲苯,、,对二甲苯、1，2，4三甲苯,等，主要适用于脂溶性药物的测定。,另一类是,醚类，1，4二氧六环,，适用于水溶性药物的测定。,种 类,10/6/2024,57,2闪烁剂,作用：,接受激发态溶剂分子退激时所释放的能量激发态基态发射出闪烁的荧光(光子)光电倍增管光电转换测量系统记录。,要求：,性能稳定、闪烁效率(闪烁剂放出光子的能量)高、淬灭耐受性好、发光衰减时间短。,常用的闪烁剂有：,对联三苯(TP)、2，5二苯基噁唑(PPO)、2苯基5(4联苯基)1，3，4噁二唑(PBD),等。,10/6/2024,58,(二)仪器简介,10/6/2024,59,1计数瓶,计数瓶(或称闪烁杯)：,一个具盖的玻璃或塑料小瓶(1020m1)，用于盛装样品和闪烁液。当放射性药物分子与闪烁液接触时，溶剂吸收放射能量并转给闪烁剂，闪烁剂将吸收的能量转变为光能(荧光)，荧光透过计数瓶壁，进入光电倍增管。,10/6/2024,60,2光电倍增管,光电倍增管：,光阴极、倍增极和阳极构成。进入光电倍增管的荧光(光子)通过光阴极表面的透明面板后，直接撞击光阴极，光阴极吸收光子能量后随即发射出光电子，光电子经数个倍增极依次放大，使电子数剧增。这些电子最后被阳极收集，产生一个电压脉冲，并由记录器记录下来,10/6/2024,61,3记录器,用于记录单位时间内所产生的电压脉冲数，该脉冲数反映了单位时间内放射性药物的核衰变次数(闪烁次数)。通常采用每分钟计数(,counts per minate，cpm,)，作为放射性同位素药物的放射性强度。,10/6/2024,62,四、标准曲线的制备与样品测定步骤,10/6/2024,63,(一)标准曲线的绘制,取标准抗原，用无放射活性的空白血清或血浆稀释成,5,8,个系列浓度。,加入定量标记抗原，其总放射性,(T),应能满足准确测量的需要。,加入定量的已稀释好的特异抗体，其抗体的量应满足灵敏度的要求。,将标准抗原、标记抗原、特异抗体与缓冲液混匀后，在适当条件下温育，待反应平衡后测定总计数率,(T),。,10/6/2024,64,加入分离剂，使结合部分,(B),与游离部分,(F),分离。,测定各管结合部分或游离部分的,计数率,。,标准曲线通常以,标准抗原(待测药物标准品)的浓度,为横坐标，以结合率,(B),为纵坐标作图。,纵坐标,B,的计算有两种方法：一种是将与抗体结合的标记药物的放射性强度,(B),与加入的标记药物总放射性强度,(T),比较，即,B=(BT)100,；另一种是用零标准管,(,不加药物标准品,),的放射性强度,B,0,代替,T,比较，即,B=(BB,0,)100,。,10/6/2024,65,(二)样品测定步骤,下述情况样品需进行简单处理：,测定方法不够灵敏，可将被测物适当浓集；,测定方法不很专属，可将被测物与其它干扰物质分离；,待测物以缀合物形式存在，可设法使其游离，然后进行测定。,10/6/2024,66,例：,125,IRIA(DCC沉淀法)测定血清中地高辛浓度,待测血清样品50l,样品管中;含不同浓度地高辛标准品的血清50l,标准曲线各管中;50l 空白人血清,零标准管,.,各管中依次加入保温液100l,抗体溶液100l,125,I标记的地高辛(溶液)100l摇匀,在室温(1525)放置30min,-计数器测定各管的总计数T(即加人的协I总放射性剂量),在电磁搅拌(或手摇)下，迅速向各管内加人1ml工作液(全部加完控制在5min内)，摇匀,离心10min(3000r/min),倾去上清液,-计数器测定各管中沉淀的计数F(游离协I地高辛放射性强度),计算出标准曲线各管和样品各管的结合率。,10/6/2024,67,10/6/2024,68,五、方法评价,灵敏度高、特异性强、取样量少、适用于大批量样品的测定。,需用放射性同位素标记抗原，其放射性对操作人员的健康、对环境的污染都会造成危害，而且还需有专用的同位素实验室及免疫测定仪器，成本较高，因而使其普及受到限制。,10/6/2024,69,六、应用示例,固相放射免疫分析试剂盒测定血清中地高辛,浓度的方法,1主要试剂,2测定方法,10/6/2024,70,3结果计算,(1)标准曲线法,以地高辛标准品血清浓度为横坐标，,B,标,T(,),为纵坐标，在半对数坐标纸上绘出标准曲线。,以地高辛标准品血清浓度为横坐标，但用,(B,标,-B,NSB,)/(B,0,B,NSB,)(,),为纵坐标作标准曲线，当测得血清样品的,(B,样,B,NSB,)/(B,0,-B,NSB,)(,),值后，也可从标准曲线上得到对应的血清药浓,10/6/2024,71,(2)回归方程计算法,以logx为自变量(x为血清中地高辛标准品的浓度)，以logitY为因变量进行直线回归,10/6/2024,72,第三节 酶免疫分析法,酶标记抗原,均相酶免疫分析,非均相酶免疫分析,方法评价,应用示例,10/6/2024,73,酶免疫分析(,Enzyme Immunoassay，EIA,)是以酶作为标记物的免疫测定方法。酶免疫分析法是1971年由,Engvall,等人在RIA的基础上发展产生起来的一种新的免疫分析方法。,10/6/2024,74,一、酶标记抗原,(一)标记酶的选择,特异性强,，酶蛋白分子中应具有足够的活性基团，以便能与药物结合。,活性要高,，即当底物浓度低时，确有较高的催化反应率。,酶的活性不易受样品中其它成分影响，有较好的稳定性。,酶的,纯度要高,，且生物体液中应无标记酶、底物、抑制剂及其它干扰物质存在。,酶的,活性测量方法,应简单、灵敏、精密和快速。,酶的来源、纯化、供应等应,方便、价廉,。,10/6/2024,75,最常用的标记酶,1辣根过氧化物酶(HRP):约有50的EIA使用此酶。,2碱性磷酸酯酶(AP):AP标记的结合物性质稳定，其活性可用分光光度计或荧光计测量。,36-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD): 通常用于均相EIA。,4,-半乳糖苷酶(-Gal): 适用于均相EIA和非均相EIA。,5苹果酸脱氢酶(MDH): 多用于尿样的均相EIA。,10/6/2024,76,(二)底物的选择,无色、无毒能溶水；,化学性质稳定、不受光照的影响；,转化率高，在酶催化下可产生大量的有色物质；,显色产物的量在一定范围内与酶的浓度或活性成正比；,应有终止酶反应的试剂。,10/6/2024,77,常用酶的底物,1、辣根过氧化物酶的底物：邻苯二胺（OPD）、5-氨基水杨酸（5-ASA）、四甲基联苯胺及其硫酸盐（TMB/TMBS）,2、碱性磷酸酶底物：对硝基酚磷酸盐溶液（p-NPP）、4-甲基伞酮基-磷酸盐（4-MUP）,3、,-D-半乳糖苷酶底物：邻硝基苯-D-半乳糖吡喃苷（o-NPG）、氯酚红-D-半乳糖吡喃苷（CPRG）、试卤灵-D-半乳糖吡喃苷（RG）,4、葡萄糖氧化酶底物：与辣根过氧化物酶底物相同,10/6/2024,78,（三）：酶标记药物的制备,酶标药物的,酶活性,和,免疫活性,决定了酶免疫测定法的灵敏度，因此酶标药物成为EIA的关键。,选择制备方法应注意以下原则：,（1）对酶和抗体的活性没有影响,（2）生成的结合物是可溶的、稳定的,（3）反应条件易控制,（4）制备方法简单、能重现,10/6/2024,79,二、均相EIA,均相酶免疫分析(Homogeneous Enzyme Immunoassay),是指酶标抗原(Ag,E,)同抗体(Ab)结合后，所形成的酶标抗原一抗体结合物(Ag,E,Ab)可使酶的活性发生改变(增强或减弱)，且不需将游离的酶标药物(Ag,E,)与结合的(Ag,E,一Ab)酶标药物分开，就可直接通过测定酶活性的变化，求出样品含量的方法。,酶增强(放大)免疫测定技术(Enzyme Multiplied Imnunoassay、technique，EMIT)，或称“结合酶免疫分析法”,10/6/2024,80,(一)测定原理,10/6/2024,81,EMIT法通常使用6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD)作标记酶，其原理是标记在待测药物上的G-6-PD在辅酶I参与下能将底物6-磷酸葡萄糖(G-6-P)氧化成6-磷酸葡萄糖酸，而辅酶I本身则被还原成还原型辅酶I(NADH)。,在该反应过程中，辅酶I的结构发生了变化，导致NAD与NADH的紫外吸收光谱形状不同，还原型辅酶I在340nm处有最大吸收，而辅酶I在此波长处则吸收甚小,。,10/6/2024,82,10/6/2024,83,(二)测定方法,未标记药物(Ag)抗体辅酶I(NAD)底物(G-6-P)抗原-抗体结合物Ag-Ab酶标药物(Ag,E,),。酶标药物与未标记药物互相竞争有限量的抗体(Ab)，当这种竞争结合反应达到平衡之后，则有部分酶标药物与抗体相结合，从而使结合酶标药物(Ag,E,-Ab)上的酶活性受到抑制，不能再同底物发生作用，而只有游离酶标药物(AgE)上的酶才有活性，能作用于底物产生测定信号。如果样品中待测药物的浓度越高，则竞争抑制的结果使游离酶标药物的量增多，亦即酶的活性随着待测药物浓度的增加而增强，故有“酶增强免疫技术”之称。,由于游离酶标药物量的增多，能使更多的NAD参与氧化反应，生成更多的酶反应产物NADH。根据NADH在340nm处有紫外吸收的原理，便可用分光光度计测定吸收度，求出待测药物的含量。,10/6/2024,84,三、非均相EIA,非均相免疫分析：指酶标抗原(Ag,E,)同抗体(Ab)结合后，形成的酶标抗原-抗体结合物(Ag,E,-Ab)与游离的酶标抗原(A,E,)一样，其标记酶都具酶活性。因此必须将Ag,E,Ab与游离的Ag,E,分开后，再测定酶活性的变化，以求出待测药物的含量。,酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)：将一种反应物固定在固相载体上，当另一种反应物与其结合后，可通过洗涤、离心等方法将液相中未结合的其它物质倾去，然后测定结合在固相上的酶活性。,10/6/2024,85,(一)测定原理,10/6/2024,86,(二)测定步骤,竞争法是将抗体直接吸附在有小孔的反应板孔内，然后将待测样品和定量的酶标药物加入孔内并混匀。将反应板置于适宜温度下温育一定时间，待酶标药物与未标记药物的竞争结合反应达到平衡后，洗去未同抗体结合的游离药物，而与抗体结合的酶标药物和未标记药物(固相载体沉淀部分)则保留在孔内。然后将底物加入孔内，结合在抗体上的酶标药物能催化底物，发生水解、氧化或还原等化学反应，从而产生可测信号。测定时以空白试验(孔内不加待测样品)作参比。,10/6/2024,87,10/6/2024,88,四、方法评价,ElA优点：,避免对人体的放射性伤害、环境的污染,酶标记物较稳定，半衰期可超过1年。,酶免疫反应通常不需要,不需要温育,不需将与抗体结合的标记药物同游离的标记药物分开，便可直接测定。,产生的信号用普通的可见一紫外分光光度计就可测定，不需昂贵的仪器没备。,缺点：,标记酶不像同位素标记物、荧光标记物那样能直接产生信号，而必须要何其它试剂，如酶底物、辅酶的参与，才能完成酶反应，引起吸收光谱等变化后方可进行测定。,10/6/2024,89,五、应用示例,血样中利多卡因的测定,1药物与试剂,试剂A：内含抗体(由利多卡因与大分子载体结合成人工抗原后免疫绵羊而得)、底物(G-6-P)及辅酶I(NAD)。保存剂（0.05mol/L tris-HCl缓冲液）。,试剂B：内含酶标药物(用G-6-PD标记的利多卡因)及保存剂(pH 7.9)。,其它试剂：标准品和质控对照品。0.055mol/L tris-HCl缓冲液,10/6/2024,90,2样品测定,精密量取血浆或血清样品50l，于2ml小烧杯中，加入TB缓冲液250l，混匀后，吸出5l置另一2ml小烧杯中，再加入TB缓冲液250l，充分混匀。然后加入试剂A50l及TB缓冲液250l，再加入试剂B 50l及TB缓冲液250l，混匀，立即将反应液吸入分光光度计的样品池中，在340nm波长处测吸收度。根据标准曲线，求出血样中利多卡因的浓度。,10/6/2024,91,3标准曲线的制备,将药盒提供的6个装有不同量的利多卡因标准品小瓶取出，在每瓶中加入1.0ml蒸馏水，即得到浓度分别为0、1.0、2.0、3.0、5.0及12.0mg/L的标准品溶液。然后分别吸取不同浓度的标准品溶液50,l代替血清样品，按样品测定方法同样操作。以吸收度为纵坐标，标准品溶液浓度为横坐标，在半对数纸上作图，即得标准曲线。并将另一瓶利多卡因质控对照品加入3.0ml蒸馏水，得浓度为4.0mg/L，供核对标准曲线用。,10/6/2024,92,第四节：化学发光免疫分析,定义：,是将化学发光反应的高度灵敏性和免疫反应的高度专一性结合起来，用于超微量物质的一种检测技术。,直接化学发光物质标记法,化学发光酶免疫分析法,10/6/2024,93,第五节：荧光免疫分析,定义：是以荧光物质作为标记物与待测药物结合，所形成的荧光标记物能与抗体发生免疫反应，引起荧光强度发生变化的一种分析方法，fluorescence Immunoassay, FIA,10/6/2024,94,【练习与思考】,1、简述免疫分析法的基本原理及应满足的基本条件？,2、简述抗原抗体反应的特点及方法的分类？,3、简述均相免疫分析和非均相免疫分析？,4、简述F与B的分离方法？,5、简述酶免疫分析中常用到的标记酶及相关的酶底物？,6、简述酶联免疫吸附测定的基本原理与操作？,10/6/2024,95,