HPLC高效液相色谱技巧

SHIMADZU,Solutions for Science,Since 1875,如何用好,HPLC,得到好结果的技巧,!,流动相,缓冲液,/,溶剂选择,梯度优化,流速选择,脱气，流速稳定,流动相制备,柱,高柱效,二级作用力,柱间变异,温度控制,检测,灵敏度,选择性,温度波动影响,样品,提取方法选择,样品溶剂选择,氧气影响,仪器,性能,稳定性,耐用性,易操作性,综合评估,分析技术的稳定性,可靠性,定量准确性,HPLC,如何得到好的结果,流动相,溶剂混和率及其制备,(1),下面的两种配制一样吗,?,水,/,乙醇,=1/1(v/v),50%(v/v),乙醇水溶液,*,混和有机溶剂时注意体积变化,混和液的密度不是两种溶剂密度的简单相加,.,25C,时，,50mL,水和50,ml,乙醇混和,最终体积为96,ml,.,水,/,乙醇,=1/1(v/v),分别量取500,ml,水和乙醇,然后混和,混和体积不是,1L.,50%(v/v),乙醇水溶液,.,加500,ml,乙醇于1,L,的容量瓶中,加水至刻度,.,水的比例更高,.,1L,Water,Ethanol,Ethanol,Water,流动相,溶剂混和率及其制备,(2),流动相,A:20mM,磷酸,(Na),缓冲液,/,乙腈,=9/1(v/v),流动相,B:10%(v/v),乙腈/,20mM,磷酸缓冲液,1,2,3,3,1,A,B,2,Peaks,1:acetaminophen,2:dihydrocodeine,3:caffeine,0,2,4,6,8,10,min,Column:Shim-Pack VP-ODS(150mmL.x 4.6mmI.D.),Flow rate:1mL/min,Temp.:40C,Detection:UV-VIS(210nm),流动相,溶剂混和率及其制备,(3),配制,:20mM,磷酸缓冲液,(pH2.5),流动相,缓冲液比例及其制备,(1),A:“20mM”,表示,磷酸浓度,加,10mmol,磷酸和,10mmol,磷酸二氢钠,溶解于,1L,水中,B:“20mM”,表示,钠浓度,溶解,20mmol,磷酸二氢钠于,1L,水中,加磷酸调,pH,至,2.5,C:“20mM”,表示,磷酸和钠的浓度,用高氯酸调节,pH,溶解,20mmol,磷酸二氢钠于,1L,水中,用高氯酸调节,pH,至,2.5,Column:Shim-Pack VP-ODS(150mmL.x 4.6mmI.D.),Flow rate:1mL/min,Temp.:40C,Detection:UV-VIS(210nm),流动相,A:,磷酸浓度为,20mM,流动相,B:,钠浓度为,20mM,流动相,C:,磷酸，钠浓度均为,20mM,用高氯酸调节,pH,流动相,缓冲液比例及其制备,(2),min,1,2,3,3,1,A,B,2,Peaks,1:acetaminophen,2:dihydrocodeine,3:caffeine,0,2,4,6,8,10,C,3,1,2,不一样的解释,Dihyrocodeine,出峰位置不一样,流动相缓冲能力弱,p,Ka,与流动相,pH,相近的酸和碱的峰形变差,.,Column:STR ODS-II (150mmL.x 4.6mm I.D.),Mobile:20mM buffer solution(pH 4.5)phase /acetonitrile(3/1,v/v),Flow rate:1mL/min,Temp.:40C,Detection:UV-VIS(240nm),左图,:,柠檬酸缓冲液,pH,(,4.5),作流动相,右图,:,磷酸缓冲液,(pH 4.5),作流动相,流动相,pH,缓冲能力和,峰形,吸光度,HPLC,级的乙腈在,UV,低波长有很低的吸收,HPLC,级的乙腈,适用于,UV,低波长下高灵敏度的分析,!,柱压,乙腈更低,.,相同流速下,引起的柱压更低,.,洗脱能力,乙腈更强,.,一些化合物甲醇容易洗脱,.(,胡萝卜素,胆固醇,),选择性,不同,.,峰形,不同,.,聚合物基底的柱子,乙腈更好,.,流动相脱气效率,与水混和时要注意,甲醇,发热,气体溢出,乙腈,吸热,气体溶解,流动相,甲醇和乙腈的不同,保留时间改变,峰面积改变,定量错误,!,对绝对量响应的检测器,流速不影响峰面积,.,对浓度响应的检测器,流速影响峰面积,.,*,几乎所有的,LC,检测器均为浓度型检测器,流动相,流速变化的影响,(1),1.0097,2914591,2886547,n,-butylparaben,1.0098,2652087,2626362,n,-propylparaben,1.0096,2771087,2744605,ethylparaben,1.0095,3938213,3901107,methylparaben,B/A,B(0.99mL/min),A(1.00mL/min),面积比,峰面积,Column:Shim-Pack VP-ODS (150mm L.x 4.6mm I.D.),Mobile phase:methanol/water =6/4(v/v),Flow rate,:A;1.00mL/min,B;0.99mL/min,Temperature:40,C,Detection:UV-VIS(260nm),流动相,流速变化的影响,(2),两台泵进行混和时,A,B,A:,一台泵输送预先混和好溶剂,B:,两台泵分别输送两种溶剂并混和,Peaks,1:methylparaben,2:ethylparaben,3:propylparaben,1,2,3,流动相,高压梯度时流速变化的影响,(1),保留时间和预先混和好的溶剂不同,1.013,3075259,3035538,n,-butylparaben,1.013,2797180,2761054,n,-propylparaben,1.013,2922556,2885602,ethylparaben,1.013,4151876,4100127,methylparaben,B/A,B,A,面积比,峰面积,Column:Shim-Pack VP-ODS (150mmL.x 4.6mm I.D.),Mobile phase:methanol/water(6/4,vol/vol),Flow rate:1.00mL/min,Temperature:40,C,Detection:UV-VIS(260nm),流动相,高压梯度时流速变化的影响,(1),A:,一台泵输送预先混和好溶剂,B:,两台泵分别输送两种溶剂并混和,气泡出现的原因,当溶解的空气超过空气的溶解度时,.,原因,:,溶剂温度升高,压力降低,溶剂混和等,.,气泡可能引起的问题,流动相,泵,保留时间波动,流动相流量不稳定,柱,峰变形,柱效降低,检测器,产生噪声,解决方法,:,离线和在线脱气,然而,问题不仅由于气泡引起,而且由于溶解的空气引起,.,流动相,流动相中的气泡引起的问题,荧光检测器,氧气引起荧光猝灭,改变峰面积,吸光型检测器,改变背景吸收,基线波动,(,特别是在梯度洗脱时,),氧气吸收峰出现,示差折光检测器,基线波动,流动相,流动相中的空气对检测器的影响,Degassed,Not degassed,*,荧光检测器分析,bisphenol A,脱气,:,氦脱气,流动相,荧光检测中脱气的影响,(1),流动相脱气可能影响荧光检测的灵敏度,.,脱气时间对气液半透膜,脱气效果的影响,.,0,1,2,3,4,5,0,10,20,30,40,50,60,脱气开始时间,(min),Peak Area Value,(10,6,),Degasser OFF,Degasser ON,Column :Shim-Pack VP-ODS (150mm L x 4.6mm I.D.),Mobile Phase:acetonitrile/H,2,O=4/1(v/v),Flow rate :1mL/min,Temperature :40,C,Analyte:Pyrene,Detection:Fluorescence (Ex 310nm,Em 390nm),Degassing:,Gas-liq.separation membrane,流动相,荧光检测中脱气的影响,(2),甲醇吸收光谱图,如果溶解的氧气浓度高，,有机溶剂的吸光度液也高,.,在短波长区影响更为明显,.,流动相,UV,检测器的背景变化,饱和空气,脱气,进流动相引起出峰,!?,流动相,溶解的空气引起,UV,检测器的出峰,Detection:UV-210nm,流动相和样品溶剂中溶解气体量不同引起出峰,流动相脱气,流动相没脱气,Oxygen bubbling,Air saturation,He bubbling,Oxygen bubbling,Air saturation,He bubbling,放大,流动相,溶解空气引起的,RID,检测器出峰,Column :SCR-101C,Mobile phase:Water,Flow rate :0.5mL/min,Temperature :85,C,Detection :RID detector,Degasser :Gas-liq.Membrane Separ.(DGU-14A),Sample :0.5%mannitol,流动相和样品溶剂中溶解气体量不同引起出峰,.,一般,环境温度影响光谱图的形状,.,波长,高温下的光谱图,由于温度变化引起的吸光度差异,低温下的光谱图,吸光度,检测,UV,检测器池温度的影响,(1),不控制温度时峰面积比较,(34,C),0.968,0.985,p-,toluic acid,0.986,0.991,Benzoic acid,0.991,0.994,Phenol,50C,40C,与,34C,时的峰面积比,Column :Shim-Pack VP-ODS (150mm L.x 4.6mm I.D.),Mobile phase :10mM acetic acid(sodium)buffer solution(pH 4.5)/Methanol=7/3,(v/v),Flow rate :1mL/min,Temperature :40,C,Detection :UV-VIS(260nm),检测,UV,检测器池温度的影响,(2),无温度控制,(RF-10AXLsuper),2025,C,面积降低了,13.5%,2025,C,面积降低了,2.2%,检测,池温度对荧光检测器的影响,(1),正常情况下,温度越高,荧光灵敏度越低,.,氮蒽分析结果,(,温度对荧光灵敏度的影响,),无温度控制,(RF-10AXL),0.77,911017,1185514,LEU,0.77,1126683,1457340,ILE,0.77,790013,1026839,MET,0.78,1226042,1565440,VAL,0.78,138426,177078,CYS,0.77,1203529,1558560,ALA,0.79,1924900,2440772,GLY,0.86,436522,505373,PRO,0.77,1017768,1315462,GLU,0.77,1204273,1570743,SER,0.77,1143925,1478447,THR,0.78,1165757,1500427,ASP,40,C,20,C,面积比,A,40,/A,20,峰面积,面积比,A,40,/A,20,峰面积,40,C,20,C,0.76,839183,1105530,ARG,0.69,336837,487433,LYS,0.79,1431665,1819675,HIS,0.76,995832,1315479,PHE,0.74,850976,1156850,TYR,仪器,:Shimadzu,氨基酸分析系统,(,用,OPA,作柱后衍生,),检测,:RF-10AXL Super(Ex 350nm,Em 450nm)(,池温度,;,2