选修三11DNA重组技术的基本工具课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,你想过吗,?,定向基因改造设想,设想一,能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？,能否让细菌,“,吐出,”,蚕丝？,设想二,能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？,设想三,经过多年的努力，科学家于,20,世纪,70,年代创立了可以定向改造生物的新技术,基因工程,。,基因工程，又叫,DNA,重组技术,。,是指,按照人们的愿望,，,在,DNA,分子水平,上进行严格的,设计,，,并通过,体外,DNA,重组和转基因技术,，,赋予生物以,新的遗传特性,，,从而创造出更符合人们需要的新的,生物类型,和,生物产品。,什么是基因工程,?,一、基因工程的概念,基因工程的别名,操作环境,操作对象,操作水平,基本过程,实质,(,原理,),结果,基因拼接技术或,DNA,重组技术,生物体外,基因,DNA,分子水平,人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,优点：,定向改造生物性状,克服远缘杂交不亲和的障碍,育种周期短,1,、,DNA,是遗传物质。,2,、DNA的双螺旋结构,3,、中心法则的提出,4,、遗传密码的破译,二、基因工程的诞生,（一）理论基础：,1),基因转移载体,质粒的发现,2),多种限制酶、连接酶，以及逆转录酶（工具酶）的发现,3)DNA,合成和测序技术的发明,4)DNA,体外重组的实现,5),重组,DNA,表达实验的成功,6),第一例转基因动物问世,7)PCR,技术的发明,（二）技术发明：,三、基因工程的原理,1,、不同生物,DNA,分子得以重新拼接的基础,（,1,）,DNA,分子的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。,（,2,）,DNA,分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。,（,3,）所有,DNA,碱基互补配对方式相同。,2,、外源,DNA,在受体内表达的基础,（,1,）基因是控制生物性状的基本单位，具有相对独立性。,（,2,）遗传信息的传递都遵循中心法则。,（,3,）生物界共用一套遗传密码。,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,在以上过程中关键步骤或难点是什么？,普通棉花,(,无抗虫特性,),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,通过运载体导入,转基因棉花含,抗虫基因,转基因棉花产生,伴胞晶体,转基因棉花有,抗虫特性,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内,提取出来,关键步骤二：,抗虫基因,与运载体,DNA,连接,关键步骤三：,抗虫基因,导入受体,(,棉花,),细胞,剪切,拼接,导入,表达,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,抗虫基因与棉花,DNA“,缝合”,抗虫基因进入棉花细胞,“分子,手术刀,”,限制性核酸内切酶,“分子,缝合针,”,DNA,连接酶,“分子,运输车,”,基因进入受体细胞的,载体,关键步骤二：,关键步骤三：,DNA重组技术的基本工具,限制性核酸内切酶,“,分子手术刀”,来源：,主要从,原核生物,中分离纯化出来。,种类：,已从近,300,种微生物中分离出,4000,种,限制酶。,作用：,1.,能,识别,双链,DNA,的某种,特定核苷酸序列,2.,使每条链中,特定部位,的两个核苷酸之间的,磷酸二酯键,断开,。,作用特点：,具有,特异性（专一性）。,一种,限制酶,只能识别一种,特定的,核苷酸序列,，并且,能在,特定的切点,上切割,DNA,分子，,限制酶的识别序列：,大多数,限制酶的识别序列由,6个,核苷酸组成，少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,作用结果,形成两种末端：,黏性末端或平末端,1,2,3,4,5,脱氧核苷酸的结构,G,1,2,3,4,5,1,2,3,4,5,A,3,5-,磷酸二酯键,3,端,5,端,3,端,5,端,一个核苷酸核糖上第,3,位的羟基与下一个核苷酸核糖上第,5,位的磷酸羟基脱水缩合成酯键，该酯键称又,3,5,磷酸二酯键。,磷酸二酯键：,磷酸二酯键：,即脱氧核糖、磷酸之间的连接,仔细观察各限制酶识别的特定序列有何特点？,限制酶的识别序列,限制酶所识别的序列的特点是：,呈现,碱基互补对称,，无论是,6,个碱基还是,4,个碱基，都可以找到一条中心轴线，,中轴线两侧的双链,DNA,上的碱基,是,反向重复,的。,黏性末端,黏性末端,EcoRI,限制酶的切割,大肠杆菌的一种限制酶,(EcoR),只能识别,GAATTC,序列,，并在,G,和,A,之间切开。,中轴线,CTTCATG AATTCCCTAA,GAAGTACTTAA GGGATT,GGCATCTTAA,AATTCCGTAG,练习使用,EcoRI,剪切,目的基因,CTTCATG AATTCCCTAA,GAAGTACTTAA GGGATT,GGCATCTTAA,AATTCCGTAG,目的基因,Sma,平末端平末端,只能识别,CCCGGG,序列，,并在,C,和,G,之间切开,。,中轴线,平末端平末端,SmaI,限制酶的切割,当限制酶,从识别序列的中心轴线处切开时，,切开的,DNA,两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫,平末端,。,限制酶的作用结果：,产生,黏性末端,或,平末端,。,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？,P,4,原核生物易受自然界外源,DNA,的入侵,，,但生物,在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机,制，以防止外来病原物的侵害。,限制酶,就是细,菌的一种,防御性工具,，,当外源,DNA,侵入时，会,利用限制酶,将外源,DNA,切割掉,，,以保证自身的,安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到,切,割外源,DNA,、使之失效,，,从而达到,保护自身,的,目的。,课后习题：为什么限制酶不剪切细菌本身的,DNA?,主要切割外源,DNA,，而对自身的,DNA,不起作用，达到保护自身的目的。原因,是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶,切几个切口？可产生几个黏性,(,平,),末端？,要切,两个切口,，产生,四个,黏性,(,平,),末端。,如果把两种来源不同的,DNA,用同一种限制酶来,切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性,(,平,),末端，然后让两者的黏,性,(,平,),末端黏合起来，就似乎可以合成重组的,DNA,分子了。,1.,下列关于限制酶的说法正确的是,A,限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中很少,B,一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,C,不同的限制酶切割,DNA,后都会形成黏性末端,D,限制酶的作用部位是特定的核苷酸形成的氢键,B,2.,在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的,DNA,片断时，需使用,A,同种限制酶,B,两种限制酶,C,同种,DNA,连接酶,D,两种,DNA,连接酶,A,3.,下列四条,DNA,片段，可能是由同一种限制酶切割而成的是,A,B,C,D,D,DNA,连接酶,连接酶的作用,：,将,互补配对的两个黏性末端,或,平末端,连接起来，使之成为一个完整的,DNA,分子。,基因进行了切割以后就有了切口，怎样才能将有切口的基因与其他基因缝合在一起呢？,积极思考,（二）,DNA,连接酶,分子缝合针,磷酸二酯键,G,A,A T T C,C T T A,A,G,G,P,A,P,把两条双链,DNA,片段,之间的缝隙,“,缝合,”,起来。,即将,脱氧核糖和磷酸,连接起来,.,要实现目的基因与载体的连接则在对其切割时应选用,限制酶。,1,、作用：,作用原理,催化磷酸二酯键形成,2,、作用部位：,3,、分类,Ecoli DNA,连接酶或,T,4,DNA,连接酶,根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：,同一种,DNA,连接酶,可把黏性末端,之间的缝隙“缝合”,起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的,DNA,分子就形成了。,类型,来源,功能,相同点,差别,EcoliDNA连接酶,T,4,DNA连接酶,大肠杆菌,T,4,噬菌体,恢复磷,酸二酯,键,只能连接,黏性末端,能连接,黏性末端,和,平末端,(,效率较低,),作用,应用,限制性核,酸内切酶,DNA,连接酶,DNA,连接酶与限制酶的比较,(1),区别：,(2),两者的关系可表示为：,使特定部位的,磷酸二酯键断裂,用于提取目的基因和切割载体,在,DNA,片段之间重新,形成磷酸二酯键,用于目的基因和载体的连接,两,DNA,片段要具有,互补的黏性末端,才能拼起来,DNA连接酶的缝合作用,可把黏性末端之间的,缝隙,“,缝合,”,起来,，,注意：,DNA,连接酶可连接双链,DNA,中的,DNA,单链缺口，,但,不能连接单链,DNA,！,Ecoli DNA,连接酶或,T,4,DNA,连接酶,可把,黏性末端,之间的,缝隙,“,缝合,”,起来,，,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,由于氢键是分子间作用力，其断裂与重新形成均以限制酶和,DNA,连接酶无关。,DNA,连接酶与,DNA,聚合酶是一回事吗？,T,4,DNA,连接酶,还可把,平末端,之间的,缝隙,“,缝合,”,起来，但效率较低,DNA连接酶的缝合作用,A A T T G,C,A,A,T,T,A,A,T,T,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶的作用,DNA,连接酶,DNA,聚合酶,相同点,作用实质,化学本质,不,同,点,模板,作用对象,作用结果,用途,都能催化,两个核苷酸之间,形成,磷酸二酯键,都是蛋白质，但组成和性质不同,不需要,需要,形成,DNA,的一条链,基因工程,DNA,复制,DNA,连接酶与,DNA,聚合酶的比较,在,两个,DNA,片段之间,形成磷酸二酯键,(,用于基因工程操作,),将单个核苷酸加到已存在的,DNA,片段的,3,端的羟基上，形成磷酸二酯键,(,用于,DNA,的复制,),将存在的,DNA,片段连接成完整重组,DNA,分子,限制性内切酶,的识别序列和切点是,GGATCC,，限制性内切酶,的识别序列和切点是,GATC,。在质粒上有酶,的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶,的切点。,（,1,）请画出质粒被限制酶,切割后所形成的黏性末端。,（,2,）请画出目的基因两侧被限制酶,切割后所形成的黏性末端。,（,3,）在,DNA,连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？,可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互补的）,（三）基因进入受体细胞的载体 分子运输车,具备哪些条件才能充当“分子运输车”？,A,、具有多个,限制酶切割位点,，以便外源基因插入其中；,B,、具有特殊的,标记基因,，便于鉴定和选择。,C,、能够在宿主细胞中,复制并稳定地保存,；,D,、对受体细胞,无害,2、载体的作用,1,、载体必须具备的条件：,3、种类：,将外源基因送入受体细胞。,质粒、,噬菌体衍生物、动植物病毒等,E,、载体,DNA,分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作,.,在受体细胞内对目的基因进行,大量复制,有,标记基因,的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。,有,切割位点,能复制并带着插入的目的基因一起复制,质粒,裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核,DNA,）之外，并具有,自我复制能力,的很小的,双链环状,DNA,分子。,最常用运载体,质粒,实际上,在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，并不具备所有条件，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。,小结,基因工程,的工具,限制酶,主要存在于原核生物中,具有专一性,(,识别序列,),切开,DNA,分子的磷酸二酯键,DNA,连,接酶,连接磷酸二酯键,种类,E.coliDNA,连接酶,T,4,DNA,连接酶,运载,工 具,具备的,条件,结构简单,大小适中,能在宿主细胞中自,我复制并稳定存在,具一个或多个限制酶切位点,具标