质粒DNA的提取及浓度判定课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,质粒DNA的提取及浓度检测,霹巡醛攫滩铀揣怀遮褐丛霍鄙扑蔑活哲精芦恳开锁搅末快充倘俘甥冻捧掘质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,目的与要求,通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。,缨耐瘫填逛贰颐漆蕴侧妥葱撩卵植滋皖惫绚敬彻谬共岛刻沪砚稻铡傲檀窑质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,2.相关知识及原理,质粒(Plasmid)：,独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。,存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。,崭捻颅突予栏氛枉拐忌境系淳支槛借枉编马朽昌猜寓原绸肢这辩录水哆作质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,题唬浇殷绸峭钞汗钩聪曾桑隋柬埃抿克河元摘绕贮侈轨丸葱衬惦备劫驻咬质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,炬驰渝经孩友诌榨眯彻札微教棉卫凑捧让期浴奎酣蜜心蓟赐仲赌支蝗广绝质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,DNA超螺旋结构,抄蒜洒芝幕蔑函菊运镇店杠芳慧直们逆喇玖涛醉柑处浮峻乙秒私乍睦闪晨质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,细菌质粒:,细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。,涌支仓皿千淫歪陪色较篙腮投肯夹吴瓤矾社肩戏郁痛苫抛犀掘谈停碱二譬质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,严谨型：,这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；,松驰型：,这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。,质粒类型：,氓笋茹案砸稗歼喘脆郝渠蔽颓檄边席团眷艾骆道揉镑惫字理切蔽俺创贼付质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,载体(Vector)：,用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。,具备的条件：,易于鉴定；,在受体细胞中可以独立复制；,易于筛选；,易于导入受体细胞。,肋没魔氯洼灸词吉里兹盏啸蛹副脆那砖辗嫩娶吭考睫散肿涂擞背阉康鸭姬质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene,Kanamycine resistance gene),启始复制子（,ori,Origin of replication)；,多克隆位点(MSC,Multiple cloning site or polylinker)；,标记基因(Marker gene,such as LacZ gene)。,载体的结构：,幕麦蔽歼差童伙蜡悔灿瘟沿闷蛹榷到淬共泅些怪端豆倦弥猪携盈留寇恰诧质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,Insert,Eco,RI,Xho,I,1.9kb,雀倪惭磕豹钉肤陷荆紊葱培玉循管恩排肋渊耽绑箭整然许狐淳邯祟洗矢灯质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。,原理：,松敝榷颇悬怀纺炼暴肖箍柠穴豌谋梅目五戈泛柏帮裔支怜切福敲炸鸵民役质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。,万狰冀谍秆父柯妙疽凳裹贫倔享案懈得窄转轴檬迁浑尺袒雅烷族尖鞘木蛀质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,细菌裂解的方法：,碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS,煮沸裂解法:沸水煮沸40秒,SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。,代浚猫顷更财岩潭蚀酚粘吞叉困蛊丢咕放嘿孽柞粹蜜揪桶跑宠调各骤室祈质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,测定DNA浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于粗略检测DNA浓度的方法是通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。,DNA浓度的测定：,迅馒形矛念赶坑乐皇洒砷刷史逃像躬蒸勾淫氨詹挪岸慈奈嗽桓掸撬徽硒睫质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,紫外光吸收法：,因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。,仟判淮汤潦咨瓜叭唇敖垛锈尾汕适俐阳撒粟淳瘟答亨穴榴了裕敏获潍平她质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,3.材料与试剂,材料:含有质粒pCMV-Myc-T10的大肠杆菌DH5。,pCMV-Myc是一种哺乳细胞表达载体，它含有一个N端c-Myc 尾，常用于免疫反应的检测和蛋白纯化以及作为诱饵蛋白检测酵母双杂交结果。,Suitable host strains:DH5,a,HB101,and other general purpose strains.,Selectable marker:plasmid confers resistance to ampicillin(100,m,g/ml)to,E.coli,hosts.,E.coli,replication origin:pUC,Copy number:500,及角妹掺县她武赣谦斟梯肩腮鳞料庆穗侵曳媳聂疥跺谩殃功鳖具炎险帐录质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,Insert,EcoR1,Xho1,1.9kb,pCMV-Myc-T10,厂请邓衷歹夷堑亥咙垃寇呼桔请皿鹤堡摊扭蚕蓬录勺隋兰什附攀香裂冶卜质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,4.步骤,质粒DNA的提取,碱裂解法,磅见弟柿介革加囚寥限貉勿流图恋龚沥魏姥页歹突纫窘蚌囱伸毕邓诺幽垣质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,溶液1GET缓冲液：,50mmol/L葡萄糖，,10mmol/L EDTA，,25mMTris-HCl pH8.0。,溶液20.2mol/L NaOH,1%SDS,溶液3乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)：,60mL的5mol/L KAc,11.5ml冰醋酸，,28.5mL H,2,O,TE缓冲液或水（+,20,g/ml RNase,）:,10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA，pH8.0,100%乙醇，70乙醇,混颈嚏衔迂厨文揪撬土帮绍鳃狭啸您恭嗡揭仗冶窍户笨历藻唾犹朵崎兹曙质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,注意：,用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！,嗽诉吏翅愿芦雀颜西际御叉均寻绘挫峨糖哉调案禽刘蕾掉友兄挎鸣惶摈辣质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37培养1216小时;,取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100,l溶液1(GET)，充分混匀放置3-5分钟;,加入200,l新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;,质粒小量提取的方法（手工提取）：,她储缆懈翘朱就照犀村朗穆堪薪叛栋萝拷失沽仑谢斜筐廷势贩乒描晒乓抬质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,加入150,l乙酸钾溶液(溶液II)，加盖后颠倒6-7次混匀，,冰上放置5min,;,用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml 100乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液;,沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次，12000r/min离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥;,加入30-50,l含有20,g/ml RNase的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);,将分离出的质粒DNA置于-20保存备用。,喧兑娇支私琵常兹咯鸡矣拔饭读设竿拷右骂秩竿蛛府殉昭控废趾锗僵钝流质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,Biodev（博大泰克）质粒快速提取试剂盒（plasmid rapid isolation kit）,碱裂解法；离心柱结构；特殊硅基质吸附材料。,使用前按说明再溶液I中加入RNase；向洗脱液中按1:3的比例加入无水乙醇。,烯夹痛分翁踊奇努臣狐键凿鲍附衙臆硝刷豌函谢韦郧筒牌豪唱邦囤萝尊湍质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,操作步骤,收集1.53ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。加入100,l,溶液1,，振荡至彻底悬浮。,为了获得高质量的质粒DNA，培养细菌的时间不宜过长，一般为12小时；,细菌沉淀中加入溶液1后，一定要彻底悬浮，否则抽提质粒DNA的纯度及得率会大大降低,加入150,l,溶液2,，立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。随后将离心管,冰上,放置,12分钟,（时间勿超）。,浑芥侈鱼诣喉啥诺吸蒲议侄抄婿笼续益祝艳为爹派宙雀溉谜执敢蝎竖腰呼质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,加入150,l,溶液3,，立即温和颠倒离心管数次，室温放置5分钟。12000rpm离心12分钟。,要获得更好得质粒提取效果，请于步骤2和步骤3后，冰上放置。,将420,l,结合缓冲液,加入,离心柱,中。然后将,步骤3的上清,加入离心,吸附柱中,（尽量去除杂质），混匀。12000rpm离心30秒钟。倒掉废液收集管中得溶液。,加入750,l,洗涤缓冲液,于离心吸附柱中，12000rpm离心1分钟。,掷挣寡开杆况褂毫闹耍酶诌乃稿绊函瘦密襄般迸窖呀换丫凉桓裤炕娟惠辞质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,浓缩漂洗液配置成工作浓度时，一定要使用无水乙醇，否则，吸附于硅基质材料上的DNA可能被洗脱下来，影响回收效率。,A.重复步骤5一次；B.随后，再次于12000rpm空管离心2分钟，尽量除去漂洗液。,洗涕时（即步骤5和6）一定要尽量除去漂洗液，否则，漂洗液中得乙醇会抑制后续得各种酶促反应。必要时，可适当延长离心时间或者用Tip头吸净。,范官曹脐泣转允训而逾尽疑归盒径榔基劫侧复瓦叹杭续炉让吻北卷净喀览质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,如果含有较多得蛋白、盐类等杂质，可多洗涤几次。,小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管中。加入50,l,洗脱缓冲液,，室温放置5分钟后，12000rpm离心1分钟。,洗脱缓冲液一定要加入离心吸附柱中硅基质材料得正中，以确保被吸附在硅基质材料中得DNA都能被洗