质粒DNA的提取课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,二、质粒DNA分离的基本步骤：,细菌培养物的生长、,细菌的收获和裂解、,抽提、纯化质粒DNA。,关键步骤,：,宿主细胞的,裂解,三、质粒DNA分离的方法：,碱裂解法、煮沸法、去污剂裂解法,碱裂解法、煮沸法-较剧烈,去污剂裂解法-较温和，适用于分离大质粒,通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA。,一、实验目的,碱裂解法提取质粒DNA,二、原理：,碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。,在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，,线性的DNA双螺旋结构,解开而被变性，尽管在这样的条件下，,共价闭环质粒DNA,的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。,当加入pH4.8的,乙酸钾高盐缓冲液,恢复pH至,中性,时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此,复性迅速,而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成,网状结构，,通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。,三、试剂,.溶液50mM 葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8.0),高压灭菌，4保存,.溶液II 0.2M NaOH,1%SDS,现配现用,.溶液III 5M KAC 60ml,11.5冰乙酸，28.5水，4保存,.3M NaAC pH 5.2 高压灭菌，4保存,.氨苄青霉素 50mg/ml,.溶菌酶 .酚/氯仿/异戊醇(25/24/1),.异丙醇 .LB培养基,10,.电泳试剂见附,11,.TE缓冲液,四、仪器与材料：,超级恒温器或恒温水浴、,冷冻离心机、,培养箱、,摇床、,微量取液器、,电泳仪、,电泳槽、,凝胶成像系统,Eppendorf管,五、操作流程：,细菌培养,离心收集细菌,裂解细菌,收集质粒,抽提纯化质粒DNA,电泳检测,五、操作步骤：,一）,细菌培养和质粒的扩增,二）裂解细菌、收集质粒DNA,1）离心收集细菌,2）裂解细菌,3）收集质粒,三）抽提质粒、分离纯化,1）柱层析,2）洗脱,3）收集质粒、保存,五、操作步骤：,一）,细菌培养和质粒的扩增,从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到LB培养基中培养。培养数小时后，加入,氯霉素,继续培养若干小时，以便对质粒进行扩增。,氯霉素,：抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。,二）裂解细菌、收集质粒DNA,1）离心收集细菌,取1.5ml菌液,室温下,5000g,离心,1min,弃上清,再加1.5ml菌液,室温下5000g,，离心,1min,弃尽上清、回收菌体,（再重复1次）,2）裂解细菌：,加250l,溶液,混悬菌体,收集的,菌体,强烈振荡,充分混匀，无可见菌块,溶液：,含50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0),RNase,溶液,葡萄糖,:能增加溶液的黏度，防止,DNA,受机械剪切。,EDTA,:,螯合Mg2+、Ca2+等金属离子,1),抑制脱氧核糖核酸酶对,DNA,的降解作用；2)同时又有利于溶菌酶的作用。,2）裂解细菌：,加250l,溶液,溶液：,含0.2mol/L NaOH，,1%SDS,用时新鲜配制,加入,250l,溶液,混悬菌体,收集的,菌体,强烈振荡,混匀,温和颠倒5次,溶液,SDS,是离子型表面活性剂，主要功能:,1）溶解细胞膜上的脂肪与蛋白；,2）解聚细胞中的核蛋白；,3）能与蛋白质结合成为,R,1,-O-SO,3,-,R,2,+,-,蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但,SDS,能抑制核糖核酸酶的作用,NaOH,浓度为0.2N，加入抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒的DNA变性。,2）裂解细菌：,加250l,溶液,加入,250l,溶液,混悬菌体,收集的,菌体,强烈振荡,混匀,温和,颠倒5次,温和颠倒,振荡5次，不能多,室温静置2-3min,（不能超过5min，,溶液变粘稠）,加350l,溶液,溶液III,5M KAC 60ml,11.5ml 冰乙酸，,28.5ml 水，4保存,溶液,是,NaAc-Hac,的缓冲液（,pH4.8,）。,1.把抽提液,pH12.6,中性,，使变性的质粒,DNA,能够,复性,，并能稳定存在。,2.而,高盐,的,3M NaAc,有利于变性的大分子染色体,DNA,、,RNA,以及,SDS-,蛋白质复合物凝聚而,沉淀,之。,（这时可以看见白色絮状沉淀）,2）裂解细菌：,冰预冷,的,溶液,加入,250l,溶液,混悬菌体,收集的,菌体,强烈振荡,混匀,颠倒混匀5次,温和颠倒,振荡5次，不能多,置室温,5min,室温静置2-3min,（不能超过5min，,溶液变粘稠）,（管中出现沉淀）,加350l的,溶液,3）收集质粒,4,13 000g离心10min,弃收集管中的液体,取上清（约700l）,加入质粒纯化柱中,13000rpm离心1min,去尽残存液体，弃收集管，,并套上另一新离心管,413 000g,离心1min,准备质粒纯化柱,加750l溶液,入质粒纯化柱,弃收集管中的液体，再离心1min,去尽溶液,溶液：洗脱液,三）,洗脱，收集质粒,纯化柱中加,50l溶液,，,室温放置1min,13000g离心1min,离心管中即为纯化的质粒,注意：,溶液必须加至柱面中央,放置时间稍长，有利于增加质粒产量。,-20保存,第二大步骤,质粒DNA 的鉴定（琼脂糖凝胶电泳,）,溶液含葡萄糖和,EDTA,，葡萄糖能增加溶液的黏度，防止,DNA,受机械作用而降解。,EDTA,可螯合,Mg,2+,、,Ca,2+,等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对,DNA,的降解作用（,Dnase,作用时需要一定的金属离子作辅基），另外，,EDTA,的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。,溶液含,NaOH,和,SDS,，核酸在,pH,大于,5,小于,9,的溶液中是稳定的，但当,pH,大于,12,或小于,3,时，就会引起双键之间氢键的解离而变性。在溶液中的,NaOH,浓度为,0.2N,，加入抽提液液时，该系统的,pH,就高达,12.6,，因而促使染色体,DNA,与质粒的变性。,SDS,是离子型表面活性剂，它主要功能有溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；,SDS,能与蛋白质结合成为,R,1,-O-SO,3,-,R,2,+,-,蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是,SDS,能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用,Rnase,去除,RNA,时）受到干扰。,溶液是,NaAc-Hac,的缓冲液（,pH4.8,）。用,pH4.8,的,NaAc,溶液是为了把,pH12.6,的抽提液,pH,调回中性，使变性的质粒,DNA,能够复性，并能稳定存在。而高盐的,3MnaAc,有利于变性的大分子染色体,DNA,、,RNA,以及,SDS-,蛋白质复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与,SDS-,蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。,通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。,一、实验目的,碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。,二、实验原理,当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。,三、仪器、材料与试剂,(一)仪器,超净工作台、超级恒温器或恒温水浴、台式离心机、培养箱、取液器、摇床、冷冻真空干燥器、低温冰箱或冰柜、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪,(二)材料,1含pQE-31质粒的大肠杆菌,21.5mL 离心管,3吸头、枪(三)试剂 质粒小量制备试剂盒(3S Spin plasmid MIniprep Kit V3.1,申能博彩公司),二：试剂,：Solution 50mM 葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8.0),高压灭菌，4保存,：Solution II 0.2M NaOH,1%SDS,现配现用,：Solution III 5M KAC 60ml,11.5冰乙酸，28.5水，4保存,：3M NaAC pH 5.2 高压灭菌，4保存,：氨苄青霉素 50mg/ml,：溶菌酶 ：酚/氯仿/异戊醇(25/24/1),：异丙醇 ：LB培养基,10:电泳试剂见附 11:TE缓冲液,(一)提取质粒,(二)质粒的琼脂糖凝胶电泳,将,5uL,洗脱液与,3uL,的,DNA(二)质粒的琼脂糖凝胶电泳,将,5uL,洗脱液与,3uL,的,DNA,四、实验步骤,二、原理：,在碱性条件下，用SDS破坏细胞壁并使菌体蛋白质和染色体DNA变性，双链解开；超螺旋闭合环状结构的质粒DNA虽变性，但由于拓扑缠绕，两条互补链,不会彼此分离,。当用酸性的高盐缓冲液调PH至中性，质粒DNA恢复原先构型，在溶液中为可溶状态；而染色体DNA不能复性，形成缠连的网状结构，而被十二烷基硫酸盐(SDS)包盖，通过离心可去除细菌碎片、染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物，从而达到提取质粒DNA的目的。获得的质粒DNA通过酚/氯仿抽提，用酒精沉淀。,