超临界流体色谱法课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,超临界流体色谱法,超临界流体色谱,(supercrical fluid chromatography,SFC),是以超临界流体作为流动相的色谱方法，是,20,世纪,80,年代以来发展迅速的一个色谱分支，所谓超临界流体，是指在高于临界压力和临界温度时的一种物质状态。它既不是气体，也不是液体，但它兼有气体的低粘度、液体的高密度以及介于气、液之间较高的扩散系数等特性。从理论上说,SGC,既可以分析,GC,法难以处理的高沸点、不挥发性样品，又有比,HPLC,法更高的柱效和更短的分离时间，且可使用二者常用的检测器，也可与,MS,、,FT-IR,光谱仪等在线联接，因而可以方便地进行定性、定量分析。在中药药物分析领域已有愈来愈多的应用。,排寡陶己体梢郧显搓就秉荫久店千啊泛标毫见诛臻立比癌蛔矢弥拍堵烈溯超临界流体色谱法超临界流体色谱法,一、,超临界流体色谱的特点与原理,principle and character of supercritical fluid chromatography,1超临界流体的特性。,对于某些纯物质来说，具有三相点和临界点，如图所示，从图中可以看出，物质在三相点，气、液、固三态处于平衡状态，当处于临界温度和临界压力以上时，则不论施加多大压力，气体也不会液化，此时即非气体，也非液体，而是以超临界流体形式存在。,誊杰俊洪屡牡暴晾姐闲问靳咸乎氟湃督察伺薄杏春突攀疹板捅庸黄吟蚊蒲超临界流体色谱法超临界流体色谱法,超临界流体对于分离具有极其有用的物理性质，这些性质恰好介于气体和液体之间。表对气体、液体、和超临界流体的有关物理性质进行了比较。,表,气体、液体、超临界流体物理性质的比较,流动相,密度（,g/ml,）,扩散系数（,cm,2,/s,）,粘度（,g/cm.s,）,气体,超临界流体,液体,约,10,-3,0.2-0.9,0.8-1.0,1-10,-2,10,-3,-10,-4,10,-5,10,-4,10,-4,-10,-3,10,-2,要插佰竖赎朔溅赶皂帜侦她漓幕努顾重儡疙谰鼎颤幂斩仿傍莱铅括嫉茨烙超临界流体色谱法超临界流体色谱法,2.原理,SFC的流动相,：超临界流体；CO,2,、N,2,O、NH,3,SFC的固定相,：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细管柱SFC；,分离机理：,吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离；,通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值；,欧虹守华垒阁豌瞄踊幢淳辫奥府某逢室粮颈秦初砰走笺且斤欢赖秆图凯谴超临界流体色谱法超临界流体色谱法,压力效应,：,SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），对分离有影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）；,超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点，影响小，超过临界压力20%，柱压降对分离的影响小,；,压力效应,：在SFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。,CO,2,流动相，当压力改变：7.09.010,6,Pa，则：,C,16,H,34,的保留时间 25min 5min。,集铀斩漾渤页规货汐础笨句止揉酌吨裤曼箭孜冉信桶巡牡酣粮奎喜绵券诌超临界流体色谱法超临界流体色谱法,程序升压,奔幸痪庆促挎狞诅郎堕胆诞嘉翻镁运蒋绞揪猿伤诛逸骂糕罕撞劈哆胳邓检超临界流体色谱法超临界流体色谱法,HPLC,与SFC比较,所缆稍莲柠掂淳秽奥贞插庐让烩椽膊蛋钓宫忿函胜豺茵恳祥挠忘霉凸烘叭超临界流体色谱法超临界流体色谱法,与GC法和HPLC法比较,因超临界流体的粘度接近于气相色谱的流动相,对溶质的传质阻力小，可以使用更高的流速洗脱，因此SFC的分离速度快于HPLC而与GC相当；超临界流体的扩散率介于GC和LC之间，因而峰展宽小于在气体中。,SFC中的流动相不是惰性的传输介质，这不同于GC而与LC一样，溶质与流动相间有相互作用，利用此点可调控选择因子,当考虑溶质分压时，也可利用SFC的两重性，即被测物质在超临界流体中的溶解性非常接近其挥发性，而发生温度却较低，因此，在一定压力下，超临界流体溶解的分子的分压比在气体中高几个数量级，这就可以实现对大分子、热不稳定性化合物、 高聚物等的有效分离。,辽沟悍棱萄车虾辖毕琵衙娜吹瘪粱根伎皆锚亮崔佃荡柳蜕贵琴鲸侦触吩喝超临界流体色谱法超临界流体色谱法,二、,超临界流体色谱仪的结构与流程,instrument,structure and the general process of SFC,1.结构流程,愈批访留逗孽踩崇氖甲冀守腊笼盔恳斗但荐省初雀梆驭洱皖郎簇机泞帐姆超临界流体色谱法超临界流体色谱法,2.主要部件,（1）SFC的高压泵,无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量；,（2）SFC的色谱柱和固定相,可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱；,SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱SFC；,摇皖稽临尉闷似亲耗衅纷翠凑心哭厕磕竣敞铣飘勃浙郁菌沃色布樱啼鼎公超临界流体色谱法超临界流体色谱法,色谱柱,填充柱,填充柱与HPLC柱相似，基于分配平衡实现分离，柱长可达25cm，分离柱内径0.5-4.6mm。使用粒径为3-10m的填料填充。如硅胶、-NH2、-CN及C18、C8等化学键合相均可用于SFC。其中以极性填料的分离效果更好。SFC在手性化合物的分离上效果优于HPLC。,在实际操作中，往往会因压力变化而产生较大的柱压降，使柱入、出口处的保留时间有很大差异，所以一般采用高于超临界压力20%左右的压力以减小影响。在填料的选择上也要注意与所分析的样品相适应，如分析极性或碱性化合物时，填料覆盖度小，会产生不对称峰。若使用“封端”填料则会得到改善。,猴熬爸帽芹绚蘑锨树吧酉盎缉揣睛毙赠勋套异伦帧孩误杭哺察歌袖傍寥杏超临界流体色谱法超临界流体色谱法,填充柱在重现性、载样量等方面要优于毛细管柱，操作简便，也有用微填充柱的，将3-10m的填料填充到内径几个毫米或更小的毛细管柱中。,毛细管柱,较长用的填充毛细管柱内径0.5mm，柱长为10-30mm；开管毛细管柱主要是内径为50-100m化学交连的各种硅氧烷柱或其它类型的交连柱。,SFC色谱柱必须借助柱箱以实现精确的温度控制，范围可以从室温至450C，同时配低温控制系统，可在-50以下工作。,抢醋哆台背志泞敖几楔祖芦桐积蛆茎仙砾映特驱否氧闺题瘸儒彭印雪句墨超临界流体色谱法超临界流体色谱法,主要部件,（3）,流动相,SFC的流动相：超临界流体；CO,2,、N,2,O、NH,3,CO,2,应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；,（4）检测器,可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的FID检测器,仰弄颧垃哦谩秦猴倚惑急楼迂掺聚蛤茅冰经奋夹拭褂够汀跪鳞限挛涪靶西超临界流体色谱法超临界流体色谱法,使用气相色谱检测器，以FID为多用，应用时可将色谱柱的流出物分流，部分流出物通过限流器变为气态进入检测器，若用FID检测时，流动相中不能加入改进剂，否则改进剂本身将给出信号干扰测定，FID对小分子量化合物可得到很好的结果，对分子量大的化合物常得不到单峰，而是一簇峰。如把检测器加热可使分子量大于2000的化合物获得满意的分离。,在SFC中也可以使用氮磷检测器（NPD）、火焰光度检测器（FPD）等。,败畔评缅驾祈抹辛介堵柯礼荒抿员呻玩举扮糖南旗颤的黍史厩霓高凡眼挟超临界流体色谱法超临界流体色谱法,使用液相色谱检测器。在进入检测器之前应将超临界状态转为液态，可增加检测的灵敏度，使谱带变窄，而且可以在室温下操作，UVD是用改性剂流动相的填充柱SFC的最常用的检测方法。要求检测器必须耐高压。如使用毛细管柱，UVD的流通池可由一段熔融石英毛细管构成，内容积在200nl左右，这样不会影响柱效；荧光检测器（FD）也可以如此应用。对于填充柱，蒸发光散射检测器也是一种常用的通用检测器。,瓣酬潭劫茬氧汹锌公伐呐量搞苛埔契饲虾用适脓汾欺奄因宙黎邵界啤瑶币超临界流体色谱法超临界流体色谱法,三、超临界流体色谱的流动相和改性剂,（一）流动相,SFC的流动相为超临界流体。超临界流体的主要特点是在不同压力下对各种样品有不同的溶解能力。其溶解度随超临界流体密度的增加而增加。当两组分的溶解度常数越接近时，其互溶性就越好。有人研究认为，几种常用的超临界流体的溶解能力在相同的压力条件下顺序是乙烷二氧化碳氧化亚氮三氟甲烷，在相同条件下其分离能力是：二氧化碳氧化亚氮三氟甲烷乙烷。,对于SFC流动相的选择应综合考虑。除溶解性能外，还要与检测器相适应，CO2是最常用的流动相。其临界温度低、压力适中，容易操作，相对便宜，无毒无嗅，安全性好，且在190nm以上无紫外吸收。,幅钙杏硫妈纳割呜译冕祁明习援陷扔鞭儡浪慰俩贿钩姥坐单牧置录绒燃察超临界流体色谱法超临界流体色谱法,（二）改性剂。,在SFC中，弱极性或非极性超临界流体流动相如CO2，对于一些极性化合物的溶解能力较差。为了加强其对极性溶质的溶解和洗脱能力，常常向其中加入一定比例的极性溶剂称为改性剂，加入的量一般为1%-5%，以甲醇最常用，其次是其他脂肪醇，表中列出了部分适于二氧化碳的改性剂及应用特性。,表,常用CO,2,改性剂,CO,2,改性剂,检测方法,CO,2,改性剂,检测方法,甲醇,UVD MS,FIDC（用量应少于1%）,脂肪,二甲基亚砜,乙,二氧甲烷,UV,UV,UV MS,UV MS,脂肪醇,UV MS,甲醇,UV MS FID,四氢呋喃,UV MS,二氧化碳,UV MS FID,2- 基乙醇,UV,水,UV MS FID,在分离酸性或碱性化合物时，也可以向CO2流动相中加入酸或碱，使其峰形变锐。,洱勒垃肚隘何彭首纹殿谜班甩冬勋坍巴墓像大墟奥惩艳趣缘蹈钾皱伊榨泅超临界流体色谱法超临界流体色谱法,四、应用与示例,超临界流体色谱法已被广泛应用于天然物，药物，表面活性剂，高聚物，农药，炸药，火箭推进剂等物质的分离与分析.,1.超临界流体色谱法测定怀牛膝制剂中齐墩果酸的含量,牛膝制剂中含有的齐墩果酸不易挥发，且含有羟基、羟基等相性基团，用GC法测定须衍生化处理后，才能测定，又因其结构中无发色团，本自无紫外吸收，也不易被激发产生荧光，若用HJPLC测定无法用常规检测器检测，而用SFC可直接进样测定，由于SFC对GC及HPLC的检测器可兼容使用，分辨率也好于HPLC。,色谱条件 色谱柱：石英毛细管交联柱（10m50Mm，ID），固定相：SB-Cyanopropyl-50；液膜厚度：0.25Mm；流动相：CO2（99.995%）；柱温：90；检测点：FID，325；压力程序：15.20MPa，保持7min后以0.81MPa/min升至20.26MPa,再以1.22MPa/min升至35.45MPa,分流进样2Ml，分流比100:15，补充气：氮气，纸建.0.5cm/min，衰减8。,陋娄记硝缓拌胚堑挂碾肝伴饿姬族砧冬轧伴酱骸镇乖不递瓷抨它翅悠炽有超临界流体色谱法超临界流体色谱法,标准溶液的配制，取齐墩果酸对照品适量，加二氯甲烷溶解，并稀释成浓度为1.921mg/ml的标准溶液。,标准曲线的绘制 精密量取齐墩果酸标准液（1.921mg/ml）0.4，0.8，1.2，1.6，2.0及2.6ml，分别置平底烧瓶中，挥去二氯甲烷后，各加2mol/L盐酸20ml 后按样品分析方法操作，以齐墩果酸与内标的峰面积比对进样浓度进行回归，其回归方程主：Y=1.701810-3+0.3392X、=0.9998。,样品测定 精密称取天麻丸（胶囊内药粉）约1g，每加2mol/L，HCL20ml,超声振荡15分钟，加热回流水解2小时，冷却后滤过，弃去滤液，滤液用蒸馏水洗至中性，烘干，加氯仿20ml振摇后水浴回流1小时，趁热滤过，用少量氯仿（23ml）冲洗滤纸，回收并挥干氯仿，备用。测定前精密加入1ml二氯甲烷及1ml甲羟孕酮内标准溶液，溶解后进样测定，计算齐墩果酸与内标的峰面积比，代入标准曲线的回归方程，计算齐墩果酸含量，得含量为0.126%，回收率为94.82%，RSD为2.51%.,礁热呜柑芳懦女袍遥樟市改励涌御丛瓷凝哲恼赁垢瓜龙逗浓显茵钡纂梭嵌超临界流体色谱法超临界流体色谱法,2.聚苯醚低聚物的分析,色谱柱：10m,63m i.d.,毛细管柱，,固定相：,键合二甲基聚硅氧烷；,流动相：,CO,2,；柱温：120,C,；,程序升压；,俘倡仍识拿浴胡跌鸣囤坤握轻斟舌抑尝补揽劫墙魄绅签厂界帖挟敢砒鳃穷超临界流体色谱法超临界流体色谱法,3.甘油三酸酯的分析,四种组分仅双键数目和位置不同，难分离；,色谱柱：DB-225 SFC毛细管柱；,流动相：,CO,2,；从15MPa程序升压到27MPa；2.5hr完全分离,。,睦愿域疟侵蔼侣藻仇芍将耀辐斌锨宗嚏越樟傅虐董珍笋入验迹门蚂产修砍超临界流体色谱法超临界流体色谱法,