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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,植物生物技术,-,过去、现在和未来,Plant Biotechnology-pastcurrentfuture prospects,Kexuan Tang （,唐克轩）,School of Agriculture and Biology,Plant Biotechnology Research Center,Fudan-SJTU-Nottingham Plant Biotechnology R&D Center,Shanghai Jiaotong University,Tel and Fax: 34206916,Email: kxtang or kxtang1,内 容,(Content),生物技术的发展及内涵,(The history of Biotechnology),基因克隆,(Gene cloning),转基因植物,(Transgenic plant),植物生物反应器,(Plant Bioreactor),植物代谢工程,(Plant metabolic Engineering),参观实验室,(Visiting laboratory),转基因植物,我们生活的地球是一个千姿百态的世界，与我们共同生活的生物约有,1000,万种，包括花鸟虫鱼、飞禽走兽,，其中植物是我们赖以生存的最重要食物来源并将我们的生活环境装扮得五彩缤纷。果分酸甜，有长有圆，有土中生的有树上长的；花分大小，有红有黄,;,是什么魔力在起作用,? -,基因,。,转基因植物,什么是基因和转基因植物？,基因,(Gene),是位于染色体上的念珠状,DNA,分子。它通过编码和控制蛋白的合成，直接参与生物形态形成，形成千姿百态的世界。,植物也和我们人类一样，会生病，知饥渴，有时还要遭受害虫的袭击,.,有些逆境是植物本身能够忍受的，有些是无法克服的。人类为了使它们生活得更好，为了我们得到足够和更为精美的食物，我们需要对它们进行改造，目前，我们采取包括转基因在内的各种手段，帮助它们对抗不利的环境。,转基因植物,什么是基因和转基因植物？,所谓的转基因植物就是将某一特定功能的基因（抗病、抗虫等）从,DNA,分子上切割下来，装在运输工具（,DNA,载体）上，导入植物体内，并使该基因在植物体内稳定遗传，表达出特定的蛋白质，赋予植物以新的特性。如果，这个基因编码的蛋白具有杀虫能力，那么它们转移到玉米的细胞中，玉米就具有了抗虫性。这种通过基因转移植入了新基因的植物叫做转基因植物（,Genetically modified plant,）,转基因技术主要用于提高植物抗逆（抗冻、耐干旱等）、抗病害、抗虫害能力、改善营养品质和生产用于治疗和预防人类疾病的生物药等。目前转基因已在,35,科,120,多种植物上获得成功。,植物遗传转化,植物转化载体的构建,一、植物基因工程载体的种类和特征,将目的基因向受体植物转化是植物基因工程的关键步骤之一。近年来建立起来的高等植物基因遗传转化的方法很多，但是归纳起来有不外乎,2,种：,一种是非生物载体介导的遗传转化,另一种是生物载体介导的遗传转化,就非生物载体转化而言，该系统又可以分为两种类型：种质转化系统和直接转化系统。,种质转化系统,：,以植物自身的生殖系统种质细胞，如花粉粒或其他细胞等为媒体的转化系统,直接转化系统,：,采用物理化学方法直接将外源基因导入受体细胞，如基因枪法、脂质体法、超声波法等,生物载体介导的遗传转化根据载体的不同可以分为病毒载体和质粒载体介导的遗传转化。,作为植物基因转化的载体，必须具有两种功能,：一是它能作为媒介将外源基因导入到植物细胞中去，并且整合到宿主细胞的基因组,DNA,上；二是它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的,DNA,序列，即启动子和复制子起始位点，以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复制和表达。,1.,病毒载体,以植物病毒作为植物基因工程的克隆载体有以下,优点：,第一，植物病毒载体能把外源基因直接导入植物细胞，并且系统地分布到整个植株，而无需经过从原生质体再生植株的过程，简化了植物基因工程中外源基因的传递过程。,第二，由于病毒具有较高的自我复制能力，在转化植物中可以得到高拷贝的外源基因，有利于外源基因的表达和功能的实现。,第三，植物病毒载体感染植物以后，病毒载体的,DNA,一般不整合到植物细胞核,DNA,上，不影响植物基因组的其它功能基因的表达。,缺陷：,第一，病毒载体不能把携带的外源基因整合到寄主染色体上，不能按孟德尔规律传递给后代；第二，病毒载体仍然存在致病的可能性，可能会诱发植物产生病害；第三，由于病毒载体本身的不稳定性，病毒载体中的外源基因很容易丢失。,2.,质粒载体,有一种土壤细菌,称为,农杆菌,(,Agrobacterium tumefaciens,),它能诱导植物伤口形成冠瘿瘤,(Crown gall),细菌的致瘤能力来源于细菌内的一个额外染色体,即质粒,(plasmid),称,Ti,质粒,.,还有一种细菌称发根农杆菌,决定毛根症的质粒为,Ri,质粒，即诱发寄主植物产生毛状根,. Ti,和,Ri,质粒是理想的基因克隆载体，通过它们可以将外源的,DNA,转移到植物细胞，并再生出能够表达外源基因的转基因植物。,Ti,质粒,是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状,DNA,分子，约有,150-200kb,大小。在病原菌致病过程中，其中的一段,DNA,分子（,T-DNA,）能够插入到植物基因组中并能够稳定表达。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，,Ti,质粒可以被分成四种类型：,章鱼碱型（,octopine,，图）、胭脂碱型,(nopaline),、农杆碱型,(agropine),和农杆菌素碱型,(agrocinoine),或称琥珀碱型,(succinamopine),。,二、根癌农杆菌,Ti,质粒,章鱼碱型,Ti,质粒结构示意图,Agrobacterium tumefaciens,infection results; tumors, poor growth, low yield.,Ti,质粒的结构,各种不同类型的,Ti,质粒都具有,T-DNA,区、毒性区、质粒复制起点、质粒结合转移位点和冠瘿碱分解位点,(,图,9-2),。其中以,T-DNA,区和毒性区在植物转化中最为重要。,（,1,）,T-DNA,区（,transfer-DNA regions,）,T-DNA,是农杆菌侵染植物细胞时，从,Ti,质粒上导入植物细胞的一段,DNA,，故称之为转移,DNA,。,T-DNA,两端各有一段,25bp,的重复序列（分别称为左边界序列和右边界序列）。,T-DNA,携带的致瘤基因实际上就是一些与激素合成有关的基因,。,T-DNA,两端的重复序列对,T-DNA,转移到植物细胞内具有重要意义。保留,T-DNA,两端的末端序列，然后用一段外源,DNA,插入或直接取代野生型,T-DNA,的部分基因可以使植物细胞的致瘤基因除去，从而导致转化的植物细胞不具有成瘤能力。,设计出具有非致瘤性的所谓,卸甲载体（,disarmed vector,）,，把我们所需的外源目的基因引入这种载体，就可以较容易地得到这种目的基因的完整转基因植株。,（,2,）,Vir,区,Vir,区段上的基因与,T-DNA,从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。,Vir,区段总长度大约,35kb,，由,7,个互补群组成，分别命名为,VirA,、,VirB,、,VirC,、,VirD,、,VirE,、,VirG,和,VirH,。,毒性区中各个位点的表达情况可以分为两种：一种是组成性表达，即在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达水平；,另一种是植物诱导性表达，即这些基因的表达必须在土壤农杆菌感染植物受伤组织时，植物细胞分泌的信号分子作用下才能启动表达。,VirA,是属于第一种情况的位点，,VirB,、,VirC,、,VirD,和,VirE,是属于第二种情况的位点。 研究发现，,乙酰丁香酮及羟基乙酰丁香酮等可作为信号分子刺激,T-DNA,的转移。,Vir,区中各个基因之间都是相互联系相互影响的，缺一不可。当,Vir,基因与,T-DNA,分别位于两个不同的复制子上时，即,Vir,区与,T-DNA,区分割开来以后，,Vir,基因仍然能够为,T-DNA,提供转移功能。,（这个特性对植物遗传转化非常重要）,（,3,）,Con,区,(regions encoding conjugations),该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（,tra,），,调控,Ti,质粒在农杆菌之间的转移。,（,4,）,Ori,区,(origin of replication),该区段基因,调控,Ti,质粒的自我复制,，故称之为复制起始区。,2. T-DNA,转移的机制,T-DNA,的转移与整合需要,vir,基因,(,virA,、,virB,、,VirG,、,virC,、,virD,和,virE,),编码产物的参与。,除了这些,Ti,质粒编码的基因之外，还已鉴定出一些位于根瘤,土壤杆菌染色体,DNA,上的基因，同样也参与了,T-DNA,转移作用。,Ti,质粒分子受到信号分子的激活作用之后，,virD,基因编码的一种核酸内切酶，先在,T-DNA,的,RB,序列中的第,3,和第,4,碱基之间切开一个单链缺口，随后在,T-DNA,同一条链的,LB,序列中切出第二个单链缺口。于是,T-DNA,便以单链形式释放出来，并在,RB,序列的引导下定向地从根瘤土壤杆菌细胞转移到寄主植物细胞。当单链的,T-DNA,转移到植物细胞之后，在有关的植物细胞酶体系的催化作用下，便会合成出互补链形成双链形式的,T-DNA,分子。 在一系列酶的参与下整合进植物基因组。这种整合是一种非正常重组。,DNA,非正常重组有几个特点：,(1) T-DNA,瞄准整合的位点没有序列特异性。即植物染色体上没有特定的序列结构供,T-DNA,进行整合识别。从理论上说，,T-DNA,整合可以在植物染色体上的任何部位发生。,(2),整合部位的植物,DNA,有一小段与,T-DNA,端点附近区域同源的序列，这种序列一般只需几个碱基的长度。,(3),在重组后的重组结合部可能找到一些额外的核苷酸序列；它们被称作填充,DNA (filler-DNA),。,(4),重组结合部的靶,DNA(,受体细胞,DNA),有少量缺失或存在更大部位的重组。,3.,植物基因转化载体系统,作为植物基因的转化载体，必须具有能把外源,DNA,转入植物并能在其中稳定表达的性能。如果载体是病原物来源的，还必须能够不导致植物产生病症和不影响植物的品质。,主要介绍以,Ti,质粒为基础的遗传转化系统,野生型的,Ti,质粒,Onc,卸甲载体,为了使野生型,Ti,质粒成为基因转化的载体，必须切除,T-DNA,上的,Onc,基因，即,“,解除,”,其,“,武装,”,，构建成所谓,“,卸甲,”,或称,“,缴械,”,载体,(disarmed vector),。在这种,Onc-,载体中，已经缺失的,T-DNA,部位被大肠杆菌的一种常用的质粒,pBR322,区段所取代。这样任何适合于克隆在,pBR322,质粒中的外源,DNA,片段，都可以通过与,pBR322,质粒,DNA,的同源重组，而被共整合到,Onc-Ti,质粒载体上。,共整合载体系统,共整合载体系统包括在,T-DNA,上的激素合成区经过突变后的,Ti,质粒和中间载体两部分。通过三亲交配法使克隆在中间载体上的外源基因从大肠杆菌进入农杆菌中，中间载体与改造的,Ti,质粒之间通过同源重组使外源基因整合到,T-DNA,区。当,T-DNA,左右边界序列之间的激素合成基因完全缺失，就能在实验室中再生转基因植株，而不是产生转基因肿瘤组织。,(,一元载体系统,),T-DNA,区,左边界,右边界,目的基因,Ori,区,vir,区,植物选择,标记基因,细菌选择,标记基因,Con,区,双元载体系统,Binary vector,双元穿梭载体通常小于共整合载体，能够在大肠杆菌和农杆菌中同时存在,。,即指由两个分别含,T-DNA,和,Vir,区的相容性突变,Ti,质粒构成的双质粒系统。,双元载体系统涉及到两个,Ti,质粒的改造。,大,Ti,质粒的改造：,主要是去除,T-DNA,上的,Onc,基因（卸甲过程），甚至完全消除,T-DNA,，保留,Ti,质粒上的其它部分，并保留在受体菌体中。小质粒只带有,T-DNA,、复制起点和选择标记基因，有些仍保留,VirG,序列，并在,T-DNA,上引入多克隆位点,目的基因,vir,区,细菌选择,标记基因,Ori,区,双元载体是指由两个彼此相容的,Ti,质粒构成的双质粒系统。,其中一个含有,T-DNA,转移所必需的,vir,区的质粒称为辅助质粒，它缺失或者部分缺失,T-DNA,区段,.,另一个则含有,T-DNA,区段，既有大肠杆菌复制启始位点，也含有农杆菌复制启始位点,.,目的基因,T-DNA,区,左边界,右边界,OriA,植物选择,标记基因,细菌选择,标记基因,OriE,目的基因,农杆菌工程菌的制备过程,：将载有外源基因的小质粒引入含卸甲的大,Ti,质粒的菌株，组成含两个质粒的转化菌株。,用于转化的标准质粒图谱,4.,发根农杆菌的,Ri,质粒,发根农杆菌和根癌农杆菌同属于根瘤菌科，均为革兰氏阴性菌。它们都可以侵染植物细胞，但引起不同的病症。根癌农杆菌感染植物细胞后诱导冠瘿瘤及合成冠瘿碱，故称为瘤诱导,Ti,质粒。发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根，这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称之为毛状根，也称为发状根，分别简称为毛根或发根，,Ri,质粒为根诱导质粒。,Ri,质粒的结构与,Ti,质粒的结构十分相似，可以分为,T,区、,vir,区、,ori,区和其它区域等几个部分。,T,区与,Ti,质粒的,T-DNA,十分的相似，包括以下的几个部分：,T,区的左右边界序列。在,Ri,质粒的左右边界上含有,25bp,的重复序列，与,T-DNA,的左右边界序列具有很高的同源性。,TL-DNA,区。该区中含有与毛状根形成有关的,rolA,、,B,、,C,、,D,基因群。,RolA,与肿瘤和毛状根的形成有关，该基因不活化时通常形成较多的不定根，而在活化的情况下与毛状根形成有关；,rolB,基因是,Ri,质粒转化过程中最关键的基因，没有该基因的参与转化细胞不可能形成毛状根组织。,rolC,、,D,不活化时不会产生性状。,TR-DNA,区。该区中含有与农杆碱合成有关的基因（,ags,）和生长素合成有关的基因（,tms1,、,tms2,）。,Ags,基因在转化的初期起着重要的作用，是不定根产生的关键。,植物遗传转化技术和方法,一、概念,随着世界人口的不断增长，要求农作物生产要大幅度提高产量。但继续靠传统的方法似乎困难很大，一个可能的解决办法是发挥非传统方法的优势，分子生物学可以弥补传统农业方法的不足。,分子生物学是生物技术的基础，分子生物技术大致包括如下几个内容：可以大概定义为基因的鉴定与分离、基因的克隆、新基因的合成及新的基因结构向细胞中转移。,植物遗传转化，又称转基因，或植物基因工程，其研究的关键是利用重组,DNA,、细胞组织培养或种质系统转化等技术，将外源基因导入植物细胞或组织，使之定向重组遗传物质，改良植物性状，培育优质高产作物新品种。自,1983,年首例转基因植株诞生，天然植物基因工程开始在人工控制下定向改良植物的遗传性状。,与常规育种方法相比，它具有以下一些特点：,不受亲缘关系的限制，可实现动物、植物和微生物间遗传物质的交流，从而充分利用自然界存在的各种遗传资源；有效地打破有利基因和不利基因的连锁，充分利用有用基因；加快育种进程,缩短育种年限。,二、历史,种子和幼苗对,DNA,的吸收,上世纪六、七十年代，人们就仿效细菌转化方法开展了植物转基因的尝试。,1974,年，,Ledoux,用细菌的,DNA,浸泡维生素,B1,缺陷型的拟南芥种子，结果观察到有少数浸泡的后代植株能在缺乏维生素,B1,的培养基上生长，这是较早的可信的种子转化法。,Hess,等用来源于红花矮牵牛的总,DNA,浸泡白色矮牵牛的种子，观察到少数后代植株开红花,2. DNA,的花粉吸收,1976,年,Hess,等进一步用人工培养萌发的花粉与外源总,DNA,溶液混合授粉，结果在后代植株中发现了外源基因表达的性状，并检测到外源基因表达的酶活性，这为后来的花粉管通道法提供了理论基础。,3.,细胞对,DNA,的吸收,三、转基因植物的应用现状,植物转基因技术在改善生物的抗性、提高生物品质、创造新种质或品种、人类保健和医药等方面具有较大应用优势。,1,种植面积,转基因作物主要分布在美洲的美国、阿根廷、加拿大、墨西哥，此外，在亚洲的中国，欧洲的西班牙和法国，非洲的南非和大洋洲的澳大利亚也均有种植。转基因作物投入商业化生产以后，发展非常迅速，种植面积每年以成倍的速度增加。,1996,年全球种植面积为,1.7,百万公顷，到,2001,年为,52.6,百万公顷，在,6,年之内增长近,30,倍。,2.,四种主要转基因作物种植情况,2001,年，种植面积最大的,4,种转基因作物为：大豆,(3330,万公顷，占同类作物面积的,46,，较,2000,年增加了,10,),、棉花,(680,万公顷，占同类作物面积的,20,),、油菜,(270,万公顷，占同类作物面积的,11,),、玉米,(980,万公顷、占同类作物面积的,7,),。,3.,种植分布,到,2001,年，已有,13,个国家的,550,万农户种植了转基因作物。,4,个主要种植国为：美国,(3570,万公顷，占,68,),、阿根廷,(1180,万公顷，占,22,),、加拿大,(320,万公顷，占,6,),、中国,(160,万公顷，占,3,),。其次发展较快的国家是澳大利亚和南非，分别比,2000,年增加了,37,，,33,。其他适度发展的国家有墨西哥、保加利亚、乌拉圭、罗马尼亚、西班牙、印尼和德国。,4.,转基因作物产品的销售情况,1995,年，全球转基因作物的销售额为,0.84,亿美元，,1996,到,1998,年依次为,3.47,，,11.13,，,22.59,，至,1999,年增到,29.31,亿美元，销售额,5,年内增加了,36,倍。据,ISAAA,预测，,2005,年达到,60,亿美元，,2010,年达到,200,亿美元。,5.,转基因改良的作物性状,目前,转基因作物性状主要集中表现为抗除草剂、抗虫等。,2001,年共种植转基因抗除草剂作物,4060,万公顷，占,77,，转基因抗虫作物,780,万公顷，占,15,，同时抗除草剂和抗虫作物,420,万公顷，占,8,。这些常被称为第一代转基因作物，即基因性状为减少投入的性状。第二代转基因性状是指增加产出性状，包括品质改良、加工增值、专用产品、医药保健等,四、遗传转化方法和技术,根癌农杆菌介导的植物转基因,根癌农杆菌,Ti,质粒介导的转基因方法是目前研究最多，机理最清楚，技术方法最成熟的转基因方法。第一批能表达外源基因的转基因植物就是用根癌农杆菌介导法获得的。迄今所获得的,200,多种转基因植物中，,80%,以上是利用根癌农杆菌,Ti,质粒介导的转基因方法产生的。,野生农杆菌的致瘤作用,图,10-1,农杆菌侵染伤口的模式图,常用的农杆菌菌株及特性,一般来说，染色体背景为,C58,的菌株生长速度快，不结球，在转化实验中易于操作；染色体背景为,Ach5,的菌株生长慢，菌株培养过程中结球，在转化实验中难于操作，其培养后不易洗掉。,转化过程,图,10-2,农杆菌侵染植物的过程,T-DNA,在植物染色体中的插入是,随机,的，它可插入任何一条植物染色体。但,插入位点常有以下特点：,优先整合到转录活跃的植物基因位点；,T-DNA,与植物,DNA,连接处富含,A,、,T,碱基对；植物,DNA,上的插入位点与,T,DNA,边界序列有一定程度的同源性,。,影响农杆菌,T-DNA,转移的因素（影响农杆菌介导的遗传转化效率的因素）,(1),农杆菌菌株,不同的农杆菌菌株有不同的宿主范围，并有其特异侵染的最适宿主。不同类型的农杆菌菌株的毒力（侵染力）不同。一般而言，三类农杆菌菌株的侵染力的排列顺序为：农杆碱型（琥珀碱型）菌株（如,A281,）,胭脂碱型菌株（,C58,）,章鱼碱型菌株（,Ach5,，,LBA4404,）。,(2),农杆菌菌株的生长时期,高侵染活力的菌株一般处在对数生长期，也即,0.31.8 OD600,范围。,1.0 OD,1x10,9,cell/ml,。一般用,0.31.0 OD600,农杆菌菌液接种植物材料。,Effect of,Agrobacterium,concentration on frequency of resistant-callus,Agrobacterium,No. callus Freq. of resistant,conc . (OD 600) tested callus ( % ),0.5 210 14.21.9 a,1.0 194 11.00.46 b,1.5 180 5.60.6 c,(3),基因活化的诱导物,Vir,区基因的活化是农杆菌,Ti,质粒转移的先决条件。酚类化合物、单糖或糖酸、氨基酸、磷酸饥饿和低,pH,都影响,Vir,区基因的活化。在操作过程中，最常用的诱导物是乙酰丁香酮（,AS,）和羟基乙酰丁香酮（,HO-AS,），但,AS,效果更佳。,Effect of acetosyringone (AS) concentration on frequency of resistant-callus,AS concentration (mg l,-1,) No. calluses tested,Freq. of resistant calluses ( % ),0 194 6.70.5 b,50 206 17.63.8 a,100 187 11.21.2 b,(4),外植体的类型和生理状态,只有处于细胞分裂,S,期（,DNA,合成期）的细胞才具有被外源基因转化的能力。因此，细胞具有分裂能力是转化的基本条件。一般来说，发育早期（幼年期）的组织细胞转化能力较强,。,Effect of different periods of embryogenic callus (EC) after subculture on frequency of resistant-callus,Days after subculture (d) No. calluses tested Freq. of resistant calluses ( % ),8 190 6.82.1 b,15 188 14.90.7 a,21 203 7.8 O.4 b,（,5,） 外植体的预培养,外植体的预培养有以下作用：促进细胞分裂，使受体细胞处于更容易整合外源,DNA,状态。田间取材的外植体通过预培养起到驯化作用，使外植体适应于试管离体培养的条件。有利于外植体与培养基平整接触。因为外植体在开始培养过程中，由于其迅速生长而出现上翘和卷曲，使农杆菌的接种切面离开培养基致使农杆菌生长受抑制而不能实现对受体的转化。,(6),外植体的接种及共培养,外植体的接种是指把农杆菌工程菌株接种到外植体的侵染转化部位。常用的方法是将外植体浸泡在预先准备好的工程菌株中，浸泡一定时间后，用无菌吸水纸吸干，然后置于共培养培养基进行共培养。共培养即指农杆菌与外植体共同培养的过程。,掌握共培养技术和条件是转化成功的关键。农杆菌附着外植体表面后并不能立刻转化，只有在创伤部位生存,816h,之后的菌株才能诱发肿瘤。因此，共培养时间必须长于,816h,。共培养时间不宜太长，否则，可能会由于农杆菌的过度生长而使植物细胞受到毒害而死亡。一般共培养时间为,2d,。,转化细胞的选择培养和高频再生,(1),转化细胞的选择,选择转化细胞是基因转化重要的步骤,(De Block,等，,1995),。转化细胞和非转化细胞在非选择培养基上生长存在着竞争，而且往往非转化细胞在这种条件下生长更具优势，转化难以成功。在选择培养中加入选择试剂可以抑制非转化细胞的生长，而对转化细胞的生长无抑制作用，从而起到选择效果。,选择试剂的使用浓度，即选择压，应根据植物的特性来定，比较敏感的植物要用较低浓度的选择试剂。另外，一般选择试剂对植物材料有毒害，直接影响植株的再生 。,选择方法归纳起来有两种：,一种是先再生后选择，即在植株再生过程不加选择压，待植株再生后再进行选择。这种做法最大的弊端是嵌合体严重，假转化体多，后期选择困难。第二种是先选择后再生，即在转化后愈伤组织诱导或不定芽分化培养的一开始就加入选择压。这种方法嵌合体少，假转化体少。,(2),高效转化体再生,转化体系的转化频率高低在很大程度取决于转化体再生系统的优劣，而再生系统的主要因素是培养基。 转化后的细胞再生困难，可能是由于选择剂的影响造成的。,植物转化的选择标记,目前广泛使用的,选择标记,是,NPT II,(neomycin phosphotransferase, type II enzyme),新霉素磷酸转移酶,能降解卡那霉素和,G418,。另外还有抗,hygromycin,的基因、,bar,基因、,CAT,（氯霉素乙酰转移酶基因）。除选择标记外，还有一些,报告基因,（,report gene),，如：,GUS,（,-,葡萄糖苷酶基因）、,bar,、,GFP,等。,抗生素对植物细胞的毒害作用,转化技术,（,1,）整株感染,一般采用种子实生苗或试管苗作为外植体，在整体植株上造成创伤，然后把农杆菌接种于创伤面上，或用针头把农杆菌注射到植物体内，使其进行侵染转化。,优点：不需经过组培过程,缺点：筛选困难,（,2,）,叶盘法,图,10-3,叶圆盘转化法,是双子叶植物较为常用的简单有效的方法 。,一般是选取健康的无菌苗利用打空器打出圆形的叶片，将刚打出的带有新鲜伤口的叶圆盘与农杆菌进行短期的共培养，农杆菌通过伤口使携带外源基因的,T-DNA,进入植物细胞，使外源基因整合进植物基因组中。叶片、叶柄、茎、子叶、子叶柄、胚轴是目前应用最广的外植体，使用哪种外植体应根据不同的植物而定。,叶圆盘转化法的操作程序,叶圆片或下胚轴切段,过夜培养的农杆菌（,25-28,0,C,） 稀释菌液,共培养,2-3,天 取出植物材料， 浸泡,3-5,分钟,无菌纸戏干,转到加有选择剂和,cefotaxime or carbinecillin (500 mg/l),的培养基上,一个月后将生长者转入含上述成分的新鲜培养基上 检测,再生 检测,（,3,）基因枪介导法,基因枪法，又称生物弹法或微粒枪法、微粒轰击法，是依赖高速的金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转化技术。基因枪法是继农杆菌介导法之后又一应用较广的遗传转化技术。,优缺点,:,优点,：无宿主限制；靶受体类型十分广泛，几乎包括所有具有潜在分化能力的组织或细胞；有特殊的应用，可将外源,DNA,转入线粒体、叶绿体，也可用于花粉转化、作图法基因克隆、启动子研究、与根癌农杆菌协同转化等；,易于操作；一枪可以命中多个目标；,细胞遭粒子轰炸后仍能成活；这一方法仅与一些物理参数有关,缺点,:,转化频率低、嵌合体较多、结果的重复性差且转化的外源基因以多拷贝居多易导致基因沉默,遗传稳定性差，而且实验成本较高。,转化原理,这种方法是在微粒子表面衣裹,DNA,然后用粒子加速器将粒子加速,高速粒子可以穿入各种组织或组织,从而完成,DNA,的输送。这一技术对于难以再生的植物的转基因较有用。,图,10-4,基因枪转基因示意图,注意事项,1.,操作应在无菌条件下进行，植物材料应是分裂旺盛的组织,2. DNA,的质量要高,3.,转化前对植物材料进行一定的渗透处理有利于,转化效率的提高,4.,转化前需要对转化参数进行优化,5.,转化后需要将材料静置培养,1,天或更长时间,才能转移到筛选培养基上选择培养,(4),电激法,原理是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔”、细胞膜上会出现短暂可逆性开放小孔，为外源物质提供了通道，籍此可以导入外源,DNA,、,RNA,、蛋白质、病毒颗粒等多种生物大分子以及核苷酸和染料等多种小分子。特别是在禾谷类作物中有发展潜力。,（,5,）,PEG,转化法,PEG,法最早用于水稻遗传转化并获得转基因水稻植株。原理是将水稻原生质体悬于含质粒,DNA,的,PEG,中，由于渗透压的作用，质粒,DNA,透过原生质体膜进入细胞内，随机地整合到水稻的基因组中，经原生质体再生成完整植株。,（,6,）花粉管通道法,花粉管通道法是由周光宇等,(1978),建立并在长期科学研究中发展起来的。原理是授粉后使外源,DNA,能沿花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。花粉管通道法转化实质是受精过程转化。花粉粒在柱头上萌发形成花粉管，不断向胚囊伸长，滴注在柱头上的外源,DNA,随着花粉管进入胚囊 。,虽然至今学术界对此方法尚存争议，但由于这种转基因技术不需要昂贵的仪器设备和组织培养技术，又不受克隆基因数量的限制，转化率显著高于其他转基因技术，还可以转移多基因控制的数量性状，,20,多年来在水稻、小麦、棉花、大豆等作物上所获得的成功实例已充分地证明了这一技术的可行性。,（,7,）超声波转化法,现在超声波击穿细胞的机制还不是很清楚，但一般认为有以下两种可能性：第一，超声波引发的空化泡破裂时产生的高压与高温冲击波可能导致局部细胞质膜的破裂，在细胞质膜复原以前，就有可能吸收周围物质如,DNA,分子等，从而发生转化现象；第二，,Zimmermann,等的电场机制模型发展而来，在超声波作用下，细胞膜内的流体静压力足够高以至于引发细胞膜的机械破裂。,（,8,）浸泡法,DNA,浸泡法包括,DNA,浸种、,DNA,浸苗、,DNA,浸胚、,DNA,浸芽四种方法。浸泡法是一种简单、快速、方便的转化方法，现已有报道证明外源基因,DNA,可通过浸泡的方式进入到植物的分生组织细胞中，并在受体基因组中整合和表达。,水稻种子浸泡法获得了转基因植株。先将灭菌种子用无菌水浸泡,12h,，然后分别转入培养皿中，皿中加浓度为,l20g,mL,的,DNA,溶液,(,溶解在,TE,中,),，液面刚好盖过种子。,28,浸泡,48h,后，转到含,30g,mL,的,G418,的琼脂上进行抗性筛选。,转基因植株的检测,基因转化操作后，外源基因是否进入受体植物细胞；进入植物细胞的外源基因是否整合到植物染色体上；整合到染色体上的外源基因是否表达以及能否产生理想的目的表型等。都需要进行系列的检测分析。,为什么要对转基因植物进行检测？,转基因植物的检测标准包括以下几个方面：,被检材料的鉴定实验要设立严格的对照,(,包括阳性及阴性对照,),；提供转化当代植株的外源基因整合和表达的分子生物学证据，包括物理数据,(PCR,、,southern,杂交，,northern,杂交，,western,杂交等,),与表型数据,(,酶活性分析或其它,),；提供外源基因控制的表型性状证据,(,如抗虫、抗病等,),；根据该植物的繁殖方式,(,有性繁殖还是无性繁殖,),，提供稳定遗传证据。有性繁殖作物需有目的基因控制的表型性状传递给后代的证据，无性繁殖作物有繁殖一代稳定遗传的证据。,一、,外源基因整合的分子检测,PCR,检测,利用,PCR,扩增检测外源基因整合时，要以被检组织,DNA,为模板，以外源基因序列设计引物进行扩增，然后用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。若被检植株基因组,DNA,中含有外源基因，则可得到扩增产物，琼脂糖胶上就会出现特异性扩增的条带。非转化植株基因组,DNA,中不含有外源基因，则无特异性扩增条带出现。,M C transgenic plants,PCR,检测只能初步判断基因是否插入植物基因组，并不能,100%,肯定是转化体，因为,PCR,很容易产生假阳性。,问题：为什么,PCR,扩增不同的转基因植株，扩增片段的分子量是一样的？,注意：,PCR,扩增可以扩增选择标记基因，也可扩增目的基因。标记基因的存在并不能完全代表目的基因的存在,2.,Southern,杂交检测,具体方法有,Southern,斑点杂交、,Southern,印迹杂交及,Southern,原位杂交（确定外源基因在染色体上的位置）三种。,Southern,杂交实验涉及四大内容：被检植物的,DNA,提取；杂交探针制备；,DNA,样品酶切、电泳、变性、印迹及杂交；杂交结果的检出。,CK,Transgenic plants,图,11-3,：转基因植株拷贝数的,Southern,检测。,C-,原品种对照。,Southern,杂交可达到的目的,检测外源基因是否插入植物基因组（比,PCR,可靠）,外源基因插入的拷贝数,3 PCR-Southern,杂交检测,由于,Southern,杂交需要,DNA,的量比较大，在转化的材料比较少时，从基因组中抽提,DNA,酶切后不能满足,Southern,杂交的需要。在这种情况下，需要根据目的基因设计引物，对转基因植株基因组,DNA,进行扩增，扩增产物转移到尼龙膜上，然后用目的基因片段作探针进行杂交检测，所以称,PCR-Southern,杂交检测。这种方法存在一定的不可靠性，所以往往不被认同。,二、外源基因表达的检测,基因表达包括转录和翻译两个水平，转录是指以,DNA(,基因,),为模板合成,mRNA,的过程，翻译是指以,mRNA,为模板合成蛋白质的过程，那么，检测外源基因的表达包括检测特异,mRNA,和特异蛋白质。,检测特异,mRNA,的主要方法是,RT-PCR,和,Northern,杂交,。,特异蛋白质表达的检测方法主要有三种,：生化反应检测法：主要通过酶反应来检测；免疫学检测法：通过目的蛋白,(,抗原,),与其抗体的特异性结合进行检测，具体方法有免疫沉淀法、酶联免疫吸咐法,(ELISA),及,Western,杂交；生物学活性的检测。,RT-PCR,：,其原理是以植物总,RNA,或,mRNA,为模板进行反转录，然后再经,PCR,扩增，如果从细胞总,RNA,提取物中得到特异的,cDNA,扩增带，则表明外源基因实现了转录,Northern,杂交,检测外源基因是否转录的分子检测手段，有杂交信号，说明基因转录了，在转录水平上表达了。其过程是：提取转基因植物的,RNA,并转膜；用目的基因的,DNA,制备探针；印迹杂交。,4 Western,杂交：在证明外源基因表达出特异的,mRNA,后，还需要进一步证明表达出的,mRNA,能翻译成特异蛋白质。若外源基因的表达产物是一种酶，则可以通过测定转化植株中该酶活性来达到检测该外源基因的表达情况之目的。若表达产物不是酶，就要采用免疫学方法检测。,Western,杂交具有很高的灵敏性，可以从植物细胞总蛋白中检出,50ng,的特异蛋白质。其原理是：转化的外源基因正常表达时，转基因植株细胞中含有一定量的目的蛋白。从植物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，经,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜上，同抗体进行杂交。根据检出结果，可得知被检植物细胞内目的蛋白表达与否、表达量的高低、及大致的分子量。,GUS,基因检测,Gus,基因是一种报告基因。,报告基因系指其编码产物能够被快速测定的一类基因，常用来检测转基因的瞬间表达。,Gus,基因来源于细菌，其功能是编码,葡萄糖苷酸酶,(,glucuronidase,，,GUS),，该酶能催化许多,葡萄糖苷酯类物质的水解。绝大多数的植物细胞内不存在内源的,GUS,活性，因而,Gus,基因被广泛用作转基因植物的报告基因。,用于,GUS,检测的常用底物有三种：,5,溴,4,氯,3,吲哚,D,葡萄糖苷酸酯,(,X,Gluc,),、,4,甲基伞形酮酰,D,葡萄糖醛酸苷酯,(4,MUG),及对硝基苯,D,葡萄糖醛酸苷,(PNPG),。,Histochemical localization of GUS activity,Localization of GUS activity was determined by staining materials for up to 60 minutes at 37 in the staining liquid ( 100 ml staining liquid includes 90 mg X-gluc, 10 mg chloromycetin, 20% (V/V) methanol, 1% (V/V) Triton-100, 50 ml buffer of NaH2PO4, pH 7.0) according to Jefferson,et al,. 22. Stained tissues were cleared of chlorophyll with 70% ethanol for three times. Photographs were taken under microscope (Olympus SZH10).,Gus,基因的定性测定：,组织化学染色法,Gus,基因的定量测定：,分光光度法,转基因植物,抗逆（耐盐、抗冻、耐干旱等）转基因植物,我国科学家在耐盐、抗冻、耐旱等基因工程上取得了一些进展，包括转基因耐盐苜蓿、耐旱草坪草和水稻，我们希望将来能够用海水浇灌植物，让广袤和干旱的西部地区变成绿洲和良田。,耐盐烟草的培育,Na,+,/H,+,逆向转运蛋白,(Na,+,/H,+,antiporter protein),是一类跨膜蛋白质，在农业领域具有应用前景。近年来，越来越多的分子生物学、生物化学、细胞学、生理学及进化学上的证据表明，大多数,Na,+,/H,+,逆向转运蛋白在植物生长发育的各个阶段和不同的部位，以不同的方式保护植物免受高浓度,Na,+,的侵害，因此,Na,+,/H,+,逆向转运蛋白基因在耐盐基因工程方面具有较高的应用价值。,耐盐基因的克隆,-,Brassica napus,Na,+,/H,+,antiporter,用于烟草遗传转化的植物载体,(pBIBnNHX1),BnNHX1,:,Brassica napus,Na,+,/H,+,antiporter gene,.,Primer positions, indicated by arrows, PCR product size and restriction enzyme (,Xba,I) site used for Southern analysis are also shown.,CaMV 35S,BnNHX1,nosT,CaMV 35S,nptII,nosT,NHXF1,NHXR1,1.55 kb,pBI121,Xba,I,再生植株,共培养,检测目的基因的整合、转录和翻译,农杆菌,筛选培养,外殖体,转基因植株,田间抗性测定、遗传分析等,烟草种子,发芽,分化芽,愈伤组织,继代,去外殖体生根培养,人工小气候培养,转基因烟草植株中,BnNHX1,基因的,Southern blot,分析,Lanes 2-8: independent transgenic plants corresponding to plant nos. 3, 5, 6, 10, 11, 15 and 23. Lane 9: pBIBnNHX1 (positive control).,Lanes 1-6: independent transgenic plants corresponding to plant nos. 5, 10, 6, 15, 23 and 11 respectively.,Lane 7: an untransformed plant,转基因烟草植株中,BnNHX1,基因的,Nouthern blot,分析,转基因烟草当代（,T,0,）对盐的耐受性分析,(a),左,:,非转基因的烟草在没有,NaCl,处理的情况下,;,右非转基因的烟草在 在,200 mM NaCl,生长,3,天,.,(b),左,:,转基因的烟草,T,0,plant (no. 11),在没有,NaCl,处理的情况下,;,右,:,转基因的烟草,T,0,plant (no. 11),在,200 mM NaCl,处理下生长,10,天,(c),左,:,转基因的烟草,T,0,plant (no. 11),在,200 mM NaCl,正常生长，开花结实,;,右,:,非转基因的烟草在没有,NaCl,处理的情况下开花结实,.,(d),左,:,转基因的烟草,T,1,plant (no. 11,，,PCR,检测含有甘蓝型油菜,Brassica napus,的,Na,+,/H,+,逆向转运蛋白基因,),在,200 mM NaCl,处理下生长,;,右,:,转基因的烟草,T,1,plant (no. 11,，,PCR,检测不含有甘蓝型油菜,Brassica napus,的,Na,+,/H,+,逆向转运蛋白基因,),在,200 mM NaCl,处理下生长,耐盐基因的克隆,-SOS2,耐盐基因的克隆,-SOS2,抗冻基因的克隆,-CBF,抗冻基因的克隆,-CBF,抗冻基因的克隆,-ICE,抗冻基因的克隆,-ICE,抗冻基因的克隆,-ICE,耐干旱基因的克隆,-,GbTPS,In many organisms, trehalose acts as protective metabolite against harsh environmental stresses, such as freezing, drought, nutrient starvation, heat and salt.,GbTPS,was found to be induced by a variety of stresses including cold, salt, drought and mannitol.,转基因植物,抗病虫害转基因植物,我国的科学家已成功地改造了来自天蚕蛾的抗菌肽基因，转入到马铃薯，获得了抗病性提高的抗病转基因马铃薯。目前利用相同的技术进行抗水稻白叶枯病、马铃薯软腐病、,花生和番茄的青枯病,等抗细菌病基因工程,研究。,我国的科学家还开展,了抗病毒基因工程研,究，研制成功了抗黄,瓜花叶病毒甜椒和番茄。,转基因棉花,对照,Transgenic rice for insect and,disease resistance,Recent studies showed that some plant lectins were toxic to BPH in an artificial diet assay (Powell et al., 1993, 1995), among which the lectin (GNA) from snowdrop (,Galanthus nivalis,) is the most toxic. GNAs toxicity to BPH and non-toxicity to mammals (Pusztai et al., 1990) makes it a potential candidate to be used in genetic engineering of rice for the control of BPH.,Snowdrop plant,Galanthus nivalis,CaMV 35S,gusA,nosT,CaMV 35S,hpt,nosT,nosT,GUS-1,GUS-2,HPT-1,HPT-2,GNA-1,GNA-2,pWGR1515,pRSSGNA1,1540 bp,1270 bp,477 bp,Kpn,I,Sac,I,RSS1,gna,P N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11,12 kb ,9 kb ,6 kb ,4 kb ,3 kb ,P N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13,GNA,Genetic analysis of R1 progeny of transgenic rice lines,_,Line,gusA,+,hpt,+,gna,+No. of plants Segregation,2,P,analyzedratio,_,W1262626353:1,hpt,0.0100.922,3:1,gusA,0.0100.922,3:1,gna,0.0100.922,W2363636473:1,hpt,0.0640.801,3:1,gusA,0.0640.801,3:1,gna,0.0640.801,
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