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,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生化中的定标和空白,定标的意义：定标就是要找出一个参考点，就是一个,K,值（或,F,值）。它是由仪器与试剂状态确定下来的。当我们测定一个标本时，无论您是用手工的方法或全自动生化分析仪，测出来的值只是一个吸光度，这个吸光度对我们没有什么意义，我们要把这个吸光度转化成一个浓度或是酶的活性。那就要乘上一个,K,值，计算并打印出来的结果对我们就有意义了。,K,值就是我们通过定标找出来的。一般上最低要求是由试剂空白与标准品。经过仪器测定出两个吸光度。,K=,标准浓度,/(A,标准,A,试剂空白,),标准液的浓度我们是知道的，这两个吸光度可以由仪器测出，这样就得出一个,K,值。无论什么样的标本，用其吸光度乘以,K,值我们就得到了答案。因此，,K,值具有非常决定性的意义，可以决定标本的准确性。,K,值的决定因素：我们看看,K,值会受到什么影响呢？第一，标准液的浓度一定要准确（标准液最好与标本一样是以血清为基质的）。,1,第二，标准液的吸光度与试剂空白的吸光度一定要准确。吸光度受仪器状况、试剂状况的影响，如果您的仪器相当稳定，试剂是影响,K,值的一个主要因素。如何确定,K,值是正确的？一般我们用质控血清来检查，最好是两种水平的质控来检查，如果质控结果很好，可以说,K,值是准确的，用这个,K,值计算出来病人的结果也是准确的，所以,K,值非常关键。,K,值的真面目：,K,值实际上代表了斜率，截距代表试剂空白，试剂空白每天都在变化，所以,K,值的稳定性决定您的仪器与试剂，如果仪器与试剂都十分稳定，那,K,值也很稳定。多长时间定一次标合适？这要看您试剂的稳定性，质控结果不好，有些项目做试剂空白可以解决，有些项目要做两点定标。酶的项目如何确定,K,值：一是计算出来的理论,K,值；,K=(TV 1000)/(SV L ),二是用有酶项目的定标液得出,K,值：目前各公司可以提供多项目的定标液，不仅有底物类的项目，也有酶类的项目。,2,生化检验中的各种空白概念,1,、试剂空白：由于生化测试测量的吸光度为相对吸光度，所以从理论上说，所有终点法的测试都需要把试剂本身的吸光度扣除。试剂本身的吸光度就是 试剂空白。测量方法是按照正常测试的试剂和样本量,3,把样本换成蒸馏水来测量。在传统手工方法中,每次测定都要做至少三个管,:,测定管、标准管、空白管。其中空白管是试剂加蒸馏水，测出来也就是试剂空白。因为 操作环境、仪器状态、试剂稳定性等变异，所以要求每次都要测定试剂空白，称为实时试剂空白。在全自动分析仪上，大体上是模拟手工操作。但许多全自动分析仪为追求速度，在设计上采用一些折中方法来测定试剂空白。以日立全系 列生化仪为例。该系列分析仪是做不了实时试剂空白，因为它们全是先加入样本后加试剂，为了折中，只好在定标时做一个试剂空白，保 存起来，需要扣除试剂空白时再减这个预先保存的值。这种做法，对于比较稳定的试剂来讲，对结,4,果影响不大。通俗的讲，日立的仪器工作流程中首先是将标本加入到比色杯中，然后依次加入,R1,试剂、,R2,试剂，所以试剂空白在每个测定项目曲线 中是无法看到的。但是,7600,从,CALIBRATION,中是可以看到的，,S1ABS,就是代表试剂空白吸光度，在,CALIBRAT ION,画面里的下方找到,Reaction Monitor,（反应监察），其中,STD(1),就是代表试剂空白反应曲线,.,为了减小误差，日立仪器会连续做两次测定，所以你看到,FIRST,和,SECOND,两条，计算时是取他们的平均值。做试剂空白目的之一就是观察试剂是否稳定，积极采取措施纠正。对于日立 的这种试剂空白测定很多仪器都采用这种方法，也叫做试剂空白校准。总的说来，自动生化仪上的试剂空白一般表现为零点吸光度，该吸光度是通过校准确立的。,5,2,、样本空白：由于溶血、脂血、黄疸等情况，会导致样本本身的吸光度对测试结果造成影响。所以对样本本身吸光度的测量，即样本空白，可以去除这 方面的影响。测量方法是按照正常测试的试剂和样本量，把试剂换成蒸馏水或生理盐水来进行测量。自动生化仪上，很难界定样本空白。与消除样本空白有关的大约有如下几点,:a).,在双试剂测定时，加入试剂,1,和样品后的吸光度可一定程度上扣除样本空白，所以有单 试剂不能扣除样本空白的说法。,b).,现在优质的试剂的抗干扰能力都比较强，比如有些双试剂，,R1,加入后先和样本孵育一段时间，将血红蛋白、脂肪,6,胆红素等反应 掉，再加入,R2,开始测定反应。在一定范围内都可以消除样本空白。,c).,现代全自动生化仪大多采用双波长测定,.,双波长测定的原则是根据干扰组分和待测物质吸收光谱的峰形特征，选择两个波长和，使干扰组分在这两个波长处的吸光系数相等，而使待测物质在两波长处的吸光系数有显著差别。以两波长分别测定分析溶液的吸光度，以两个吸光度值之差,(A),计算。这也可以扣除一部分样本空白,.d).,有些仪器,例如日立系列,有专门的“血清信息”功能的设置。做法都是单 独占用一个空白通道来计算，这也叫做样品空白校准。,3,、水空白：比色杯在加入水以后的吸光度。水空白的意义主要是对光路系统进行检查和校正，如光源，比色杯等，同时在计算中起到消除“杯差”的 作用。日立,7060,中的,Cell Blank,（杯空白）测定的就是水空白。,7,全面质量控制的内容,全面质量控制的内容主要包括分析前、分析中、分析后这三个主要过程的质控。,只有认真的检测和控制这三个过程中各个环节可能出现的误差，才能保证最后检测结果的准确性，才能达到我们的质量要求。,8,（一）分析前质控,人员培训,实验室的设置,（水、电、相关设备、用具等）,实验仪器的质量保证,(,仪器的精度、波长的准确度,),检测方法的选择和评价,（重复实验、回收实验、干扰实验、方法比较实验）,试剂和标准品的选择和评价,（线性范围测定、反应曲线的观察、稳定性实验）,标本准备,（血清、血浆、胸腹水等,),9,（二）分析中质控,建立项目操作程序,标准化的操作规程（,SOP,文件）。,室内质控和结果分析,对各个项目进行室内质量控制，并对质控结果进行分析与处理。,10,（三）分析后质控,审核实验结果,室内质控的数据管理,参加室间质量评价,建立投诉调查与反馈机制,11,二、临床生化检验室内质量控制,（一）、概念与意义,室内质量控制：,指各实验室为了监测和评价本实验室工作质量，以决定常规检验报告能否发出，而采取的一系列检查，控制手段，包括实验室工作的全过程。,意义：,是检测常规工作中的精密度，并观察准确度的改变，提高本实验室常规工作中天内与天间标本检测的,一致性,。,12,要进行室内质量控制就必须要有,指示物,对各项目的质量进行指示和判断，来说明质量好坏的情况，,指示物,就是我们需要的,控制物（也称质控物）,。,控制物定义（也称质控物）：,含有被检测的化学成份，用于监测实验室的,精密度和准确度,的一种指示血清（溶液）称之为控制物。,标准品定义（参考物）：,是指它的一种或几种物理或化学性质已经充分被确定，被用于,校准仪器或证实一种测定方法,的物质。,13,2,质控品应具备的特性,人血清基质，因它的基质效应小,.,无传染性,.,添加剂和调制物的数量尽可能少,.,瓶间变异小，,（,1,）酶类项目瓶,CV,应小于,2,，,其它分析物,CV,应小于,l,（,2,）某些不稳定成分,(,如胆红素、,ALP,等,),在复溶后前,4,小时的变异应小于,2,.,（,3,）冻干品其复溶后，,2,8,环境中稳定不少于,24h,，,20,环境中稳定不少于,20,天，,到实验室后的有效期应在,1,年以上,.,14,室内质控血清浓度水平要求,、三级以上医院的临床实验室，定量测定每批,(,不超过,24,小时,),至少使用两个浓度水平的质控血清。,、二级、一级医院临床实验室，至少使用一个浓度水平,(,医学决定水平,),的质控血清。,、,医学决定水平：,是指某项待测物的含量，围绕该浓度的升高或降低，对确定疾病的诊断或治疗起帮助甚至关键的作用。,15,统计学的基本概念,、精密度：,测定值与均值之间的差值情况称为精密度，差值越大精密度越差，反之越好。,、准确度：,测定值与真实值之间的差值情况称为准确度，越接近真值准确度也好，反之就越差。,16,17,室内质量控制的主要方法,常规质控图（,S,）法,Westgard,多规测质控法,6,西格玛,质控图法,4,.,日常标本测定结果均值图法,18,常规质控图（,S,）法,这种方法操作简单，直观，易懂，它具有成熟的理论和实际经验，它只需要单一浓度的质控血清就可实现对临床进行室内质量控制，是目前国内外采用最广泛的一种常规室内质量控制的方法。,也称为均值,-,标准差质控图法，也称,levey-Jenning,质控图法。,19,在纵坐标上标出,X,、,X,2SD,、,X,3SD,的标志，横纵标上标出日期或次数。,用红笔划出,X,2SD,作,为警告线；,用蓝笔划出,X,3SD,作为出控线。,这样称为一张空,OCV,或,RCV,图。,质控图上所包括的内容,20,常规靶值,、,控制限,的确定：,一个月结束后,将该月的,在控结果,与前,20,个质控测定结果汇集在一起，计算累积,X,、,S,、,CV,再作为第二个月的,IQC,的暂定,靶值,和,控制限,，观测第二个月的,IQC,。,以此重复个月建立常规的,靶值,、,控制限,。,在计算累积值的时候需去掉超过,3SD,的数据,21,室内质控的结果分析,（,1,）测定值的分布规律,95%,的测定结果应落在,X,2SD,范围内。,不能有连续,5,次结果逐渐上升或下降。,不能有连续,5,次结果在均值的同一侧。,不能有连续,2,次结果在,X,2SD,以外。,不能有数据落在,X,3SD,外。,如违反上述规律时，称为失控。,22,（）质控图的几种失控表现,曲线漂移：,是由于系统误差造成，准确度发生了一次性的向上或向下的改变，这种往往是由于一个突然出现的新的情况引起。如更换质控血清、试剂及操作人员。,23,趋势性变化,：质控图趋势性向下或向上变化。表明检测的准确度发生逐渐的变化，这种变化多发生是由于一个逐渐改变的因素造成的。如试剂的挥发、吸水、沉淀等。,24,精密度变化,：,仪器、试剂或方法学不稳定,25,8,、,失控后处理,迅速回顾，检查整个操作过程。是否有发生错误的,环节,，包括,试剂、方法、波长,，,以及程序等出现差错。,如操作步骤均无问题，可重复试验一次，如有改进，,说明误差很可能操作错误所致,，标本量，试剂量的错误，或波长选择错误所致。,如仍不能更正，可取一份,新鲜,的控制血清重作。,仍不能解决问题，取一份,定值血清重做,。,仍不能解决，应,仔细检测仪器,。,仍未得到纠正，,试剂、质控血清重新配制和溶解,，,仪器保养检修，全部重新查找原因直到问题解决,。,26,1,、方法：,要求在常规条件，同时测定,2,份不同浓度的定值质控血清，所含测定物浓度最好分别为医学决定水平的上限或下限。,Westgard,多规则法,27,2,常用的质控规则,质控规则以符号,A,L,表示：,(1),A,是指超过质控限,(L),的质控测定值的个数,(2),L,是质控界限。,(3),1,2s,质控规则,A=1,L=2s,当质控测定值超过了规定某规则要求时，应判该批分析违背此规则。,28,1,2s,：有,1,个质控测定值超过,X,2s,，该规则称为“警告规则”,。,29,1,3s,规则：,1,个质控测定值超过,X,3s,质控限。此规则多由随机误差造成,30,2,2s,规则,:,2,个连续的质控测定值同时超过,X,2s,或,X,2s,质控限。此规则主要由系统误差造成,31,R,4s,规则：在同一批内进行两种不同浓度质控品监测时,高浓度测定值与低浓度测定值之间的差值超过,4s,。此规则多由随机误差造成。,32,4,1s,规则：,4,个连续的质控测定值同时超过,X,1s,或,X,1s,。此规则主要由系统误差造
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