第十章 微生物细胞破碎原理与技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,定义,:,细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破坏,细胞壁,和,细胞膜,，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采用不同的分离手段进一步纯化,.,第十章 微生物细胞破碎原理与技术,为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构,微生物,革兰氏阳性细菌,革兰氏阴性细菌,酵母菌,霉菌,壁厚,/nm,20-80,10-13,100-300,100-250,层次,单层,多层,多层,多层,主要组成,肽聚糖,（,40-90%,）,多糖,胞壁酸,蛋白质,脂多糖,（,1-4%,）,肽聚糖,（,5-10%,）,脂蛋白,脂多糖,（,11-22%,）,磷脂,蛋白质,葡聚糖,（,30-40%,）,甘露聚糖,（,30%,）,蛋白质,（,6-8%,）,脂类,（,8.5-13.5%,）,多聚糖,（,80-90%,）,脂类,蛋白质,一、细胞壁的组成和结构,细菌,破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；,酵母细胞壁,破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；,由于,霉菌细胞壁,中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。,为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是网状结构的,共价键,。各种微生物的细胞壁的结构和组成差异很大，壁结构不仅取决于遗传信息，也取决于生长的环境，真菌的壁结构还随发酵罐中混合的机械作用而变化。,在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞壁的结构和组成显得特别重要,，可用来作为选择溶菌酶和化学方法的依据。,分 类,作 用 机 理,适 应 性,机,械,法,珠磨法,固体剪切作用,可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难,高压匀浆法,液体剪切作用,可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌,超声破碎法,液体剪切作用,对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作,X-press,法,固体剪切作用,破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合,非,机,械,法,酶溶法,酶分解作用,具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差,化学渗透法,改变细胞膜的渗透性,具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差,渗透压法,渗透压剧烈改变,破碎率较低，常与其他方法结合使用,冻结融化法,反复冻结,-,融化,破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物,干燥法,改变细胞膜渗透性,条件变化剧烈，易引起大分子物质失活,二、微生物细胞的破碎技术,基本说出,细胞破碎机理图,1,、机械方法,为了粉碎微生物细胞，常常选择机械的方法，因为它们的,处理量大,，,破碎速度较快,。采用这些方法，细胞受到由,高压产生的高剪切力,，但在大多数情况下要,采取冷却措施,，以便除去由于消耗机械能而产生的过多热量，防止生化物质破坏。,（,1,）珠磨机,研磨,是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。,高速组织捣碎机,和,Braun,匀浆器,是实验室规模的细胞破碎设备，利用玻璃小珠撞击微生物细胞而达到破碎的目的。,这些装置的主要缺点是在破碎期间样品,温度迅速升高,，通过用二氧化碳来,冷却,容器可得到部分解决。,在工业规模的破碎中，可以采用,高速珠磨机,。在这种设备中，由于圆盘的高速旋转，使细胞,悬浮液和玻璃珠相互搅动,，细胞的破碎是由,剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动,而引起的。,（,2,）高压匀浆器,采用,高压匀浆器,是大规模破碎细胞的常用方法。利用高压迫使细胞悬浮液通过,针形阀,，由于突然,减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂,。,在工业规模的细胞破碎中，对于酵母菌等,难破碎的,及,浓度高,或处于,生长静止期,的细胞，常采用,多次循环的操作方法,。,（,3,）,X,press,法,另一种改进的高压方法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至,25,至,30,形成冰晶体，利用,500MPa,以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于,冰晶体的磨损,，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。此法称为,X,press,法,，主要用于实验室中。,该法的,优点,是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高。,该法,对冷冰融解敏感的生化物质不适用,。,（,4,）超声波法,细胞的破碎是由于,超声波的空穴作用,，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。,对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，,杆菌比球菌易破碎,、,革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎,，,对酵母菌的效果极差,。,超声波振荡容易引起,温度的剧烈上升,，操作时可以在细胞悬浮液中投入冰或在夹套中通入冷却剂,进行冷却,。,该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。,（,1,）酶解法,利用酶反应，分解,破坏细胞壁上特殊的键，,从而达到破壁的目的。,2,、非机械法,非机械方法很多，包括酶解、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法和化学法溶胞等。,常用的溶酶,溶菌酶、,-1,，,3-,葡聚糖酶、,-1,，,6-,葡聚糖酶、,蛋白酶、,甘露糖酶、,糖苷酶、,肽键内切酶、,壳多糖酶等,溶菌酶主要用于细菌类,细胞壁溶解酶是几种酶的复合物,溶菌酶是应用最多的酶,，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的,-1,，,4,糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。,外加酶法,对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质,-,甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。,酶溶法的优点：,选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。,缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。,在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。,自溶作用,是酶解的另一种方法，,所需溶胞的酶是由微生物本身产生的,。,影响自溶过程的因素有温度、时间、,pH,缓冲液浓度、细胞代谢途径等。,自溶法在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，,自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低,。,（,2,）渗透压冲击,是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。,（,3,）反复冻结一融化,，可用于某些细胞的破碎，或释放某些细胞组分。冻结融化法系将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。,由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加了细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞突然膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低，即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。,（,4,）干燥法,可采用,空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥,等。它使,细胞膜渗透性改变,，当用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就容易被抽提出来。,空气干燥主要适用于酵母菌，一般在,25,30,的气流中吹干，然后用水、缓冲液或其它溶剂抽提。空气干燥时，部分酵母可能产生自溶，所以较冷冻干燥、喷雾干燥容易抽提。,真空干燥适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质，将冷冻干燥后的菌体在冷冰条件下磨成粉，然后用缓冲液抽提。,（,5,）化学渗透法,:,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,如,Triton X-100,是一种非离子型清洁剂,，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。,其他的表面活性剂，如,牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠,等也可使细胞破碎。,表面活性剂,可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。,处理,G-,细菌，对细胞外层膜有破坏作用。,G-,细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子,Ca,2+,或,Mg,2+,结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦,EDTA,将,Ca,2+,或,Mg,2+,螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。,EDTA,螯合剂,酸碱,使蛋白质易于溶解,能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。,甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。,有机溶剂,变性剂,盐酸胍（,Guanidine hydrochloride,）和脲（,Urea,）是常用的变性剂。,变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。,不同细胞可采用的化学渗透处理方式,细胞类型,变性剂,清洁剂,有机溶剂,酶,抗生素,生物试剂,螯合剂,革兰氏阴性细菌,*,*,*,*,*,*,革兰氏阳性细菌,*,*,*,酵母菌,*,*,*,*,*,*,植物细胞,*,*,*,*,巨噬细胞,*,*,*,*表适用,通用性差；,时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过,50%,；,有些化学试剂有毒。,化学渗透法优点：,缺点：,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；,细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,值得一提的是，除了应研究破碎细胞的方法外，还应研究在生物合成过程中减低细胞牢固程度的方法。,三、破碎率的测定,为了测定细胞破碎的程度，获得定量的结果，就需要精确的分析技术，可采用以下几种方法：,1,、直接测定法,利用,显微镜或电子微粒计数器,可直接计数完整细胞的量，所以可用于破碎前的细胞计量。可是破碎过程中所释放的物质如,DNA,和其他聚合物组分会干扰计数，此时可采用,染色法,把破碎的细胞从未损害的完整细胞中区别开来，以便于计数。例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成革兰氏阴性菌的颜色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色，而受损害的酵母细胞呈现亮红色。,2,、测定释放的蛋白质量或酶的活力,细胞破碎后，测定悬浮液中,细胞内含物的增量,来估算破碎率。通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中,蛋白质的含量或酶的活力,，并与所获得的,标准数值直接比较,。,3,、测定导电率,利用破碎前后,导电率的变化,来测定破碎程度的快速方法。导电率的变化是由于细胞,内含物被释放到水相中,而引起的。,导电率随着破碎率的增加而呈线性增加,。因为导电率的读数取决于微生物的种类、处理的条件、细胞浓度、温度和悬浮液中电解质的含量，因此，,应预先采用其他方法来进行标化。,四、选择破碎方法的依据,1,、细胞的处理量,2,、细胞壁的强度和结构,3,、目标产物对破碎条件的敏感性,4,、破碎程度,适宜的操作条件应从高的产物释放率，低的能耗和便于后步提取这二方面进行权衡,五、破碎技术研究的方向,1,、多种破碎法的结合,化学法与机械法结合；酶法与机械法结合,如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，,95MPa,压力下匀浆,4,次，总破碎率接近,100%,。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有,32%,。,在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如,pH,、,温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结