【生物工程下游技术】第七章_双水相萃取

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第七章 双水相萃取技术,溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件下，水相也可以形成两相,(,即双水相系统,),甚至多相。于是有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务。,有机溶剂萃取的不足：,许多蛋白质,都有,极强的亲水性，不溶于有机溶剂；,蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。,聚合物的不相溶性：,主要是由于聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗,透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的,水相，所以具有强烈的相分离倾向。,某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合时，只要浓,度达到一定值，也会形成两相，即聚合物,盐双水相体系,系统含水量多达,75%,90%,两相界面张力极低,有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递,分相时间短,(,特别是聚合物,/,盐系统,),自然分相时间一般只有,5,15min,。,双水相萃取技术易于连续化操作。,目标产物的分配系数一般大于,3,大多数情况下,目标产物有较高的收率。,大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固液分离方法相比,双水相萃取技术可省去,1,2,个分离步骤,使整个分离过程更经济。,设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。,双水相萃取技术的优点,一、双水相分离理论,1,、,双水相的形成,熵增,混合,自发,分子间作用力,-,随着,Mr,的增加,而增大,.,聚合物的不相容性,-,含有聚合物分子的溶液发生分相的现象,.,常用聚合物：,聚乙二醇葡聚糖,聚乙二醇无机盐系统,无毒原则,2,、相图,临界点,(critical point),：,当系线长度趋于零时,两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为,1,。如,C,点。,均相区,两相区,双节线,系线,聚合物的分子量越高，相分离,所需的浓度越低,两种聚合物的分子量相差越,大，双节线的形状越不对称,。,3,、物质在两相中的分配,和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数,K,表示。,C,T,K=,C,B,C,t,、,C,B,分别代表上相、下相中溶质的浓度,K,与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。,1,）表面自由能的影响,(,大分子物质表面性质对,K,影响很大,),2,）表面电荷的影响,(,盐效应：两相系统中如存在盐,对,K,影响较大,),3,）综合考虑,（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验）,4,）影响分配平衡的参数,(1),聚合物的影响；,(2),体系中无机盐离子的影响；,(3),体系,PH,的影响；,(4),体系温度的影响；,(5),体系中微生物的影响。,1,）表面自由能的影响,2,）表面电荷的影响,道南电位,(,Donnan,potential,):,实际双水相系统中有电解质,当这些离子在两相中,K,1,则两相间产生电位差,U2,，,U1,相,1,和相,2,的电位,Z,+,Z,分别表示一种盐的正负离子的离子价,F,法拉第常数,T,温度,进一步可证明：,InKi,*=,InKi,+,ZiF(U2-U1),RT,Ki,*i,组分带电时在体系中的分配系数,Ki,i,组分不带电时在体系中的分配系数,Zi,i,组分的离子价,意义：,A,荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比,.,B,由于同一双水相系统中添加不同的盐产生的,不同,故,k,与,Zi,的关系因盐而异。,3,）综合考虑,4,）影响分配平衡的参数,(1),聚合物的影响,A,聚和物的分子量的影响,当聚合物的分子量降低时，蛋白质易分配于富含该聚合物的相。例如在,PEG,DeX,系统中，,PEG,的分子量减小，会使分配系数增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降低。这是一条普遍的规律，不论何种成相聚合物系统都适用。,(P135),B,成相聚和物浓度的影响,当接近临界点时，蛋白质均匀地分配于两相，分配系数接近于,1,。,如成相聚合物的总浓度或聚合物盐混合物的总浓度增加时，系统远离临界点，系线的长度也增加，此时两相性质的差别也增大，蛋白质趋向于向一侧分配，即分配系数或增大超过,1,，或减小低于,1,。,(2),体系中无机盐离子的影响,盐离子在两相中有不同的分配，因而在两相间形成电位差，由于各相要保持电中性，因此对于带电荷的蛋白质等物质的萃取来说,盐的存在就会使系统的电荷状态改变,从而对分配产生显著影响。（,P137,）,盐的种类对双水相萃取也有一定的影响,因此变换盐的种类和添加其他种类的盐有助于提高选择性。,在不同的双水相体系中盐的作用也不相同。在,PEG/,磷酸盐,/,水中加入氯化钠可以使万古霉素的分配系数由,4,提高到,1 2 0,而在,PEG/,DeX,/,水体系中只从,1.55,提高到,5,。,(3),体系,PH,的影响,pH,会影响蛋白质中可以离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数。,pH,也影响磷酸盐的离解程度，若改变,H,2,PO,4,-,和,HPO,4,2-,之间的比例，也会使相间电位发生变化而影响分配系数。,pH,的微小变化有时会使蛋白质的分配系数改变,23,个数量级。,交错分配法,(cross partitioning):,当加入不同种类的盐时，由于相间电位不同，,ln,k,pH,关系曲线也不一样。但在,pI,处，,k,应相同，即两条关系曲线交于一点。所以,通过测定不同盐类存在下,ln,k,pH,曲线的交点,可测定蛋白质,/,细胞器以及微粒的,pI,。,血清蛋白,(4),体系温度的影响,温度影响小,一般温度改变不影响产物的萃取。大规模操作一般在室温下进行,不需冷却。这是基于：,(1),成相聚合物,PEG,对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质不会,发生变性,;,(2),常温下溶液粘度较低,容易相分离,;,(3),常温操作节省冷却费用,.,二、双水相萃取技术的应用,1.,双水相萃取法常用于胞内酶提取和精制。,目前已知的胞内酶约,2500,种，但投入生产的很少。原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离的方法，但非常困难。,双水相系统可用于细胞碎片以及酶的进一步精制。,要成功地运用两水相萃取的方法，应满足下列条件：,欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中；,酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过一次萃取，就能得到高的收率；,两相用离心机很容易分离。,工程方面的问题,在进行工业应用时，需考虑达到萃取平衡所需的时间和两相分离的设备。,在两水相系统中，虽黏度高，但表面张力很低。因而进行搅拌时很易分散成微滴，故几秒钟即能达到平衡，且能耗也很少。,两相分离则比较困难，这是由于两相密度差低和当处理匀浆液时，粘度较大。由于粘度较高会引起阻塞，可采用自动排渣的喷嘴分离机。,PEG/,盐更适合用重力沉降；,PEG/,DeX,多用离心机,。,在两水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反应，可以把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。这实际上是一种反应和分离耦合的过程，有时也称为萃取生物转化；如果发生的是一种发酵过程，则也称为萃取发酵，因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应器。,2.,两水相反应器,enzyme,enzyme,enzyme,enzyme,enzyme,Enzymetic,reaction,substrate,product,enzyme,enzyme,enzyme,Enzymetic,reaction with ATPS,要进行两水相生物转化反应应满足下列条件：,催化剂应单侧分配；,底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分配在另一相中；要有合适的相比。如产物分配在上相中，则相比要大，反之则相比要小。,这些条件不可能同时满足，分配理论也不完善，因此常需要根据试验选择最优系统和操作条件。,采用两水相系统进行生物转化反应有下列优点：,与固定床反应器相比，不需载体，不存在多孔载体中的扩散阻力，故反应速度较快，生产能力较高；,生物催化剂在两水相系统中较稳定；两相间表面张力低，轻微搅拌即能形成高度分散系统，分散相液滴在,10,m,以下，有很大的表面积，有利于底物和产物的传递。,三、双水相萃取技术的发展,1.PEG,衍生物：在,PEG,上引入亲和基团或离,子基团；,2.,采用多级萃取。,作业：,第七章 双水相萃取,1.,普通的溶剂萃取法不适宜分离提纯蛋白质，其原因是：,(1),;(2),2.,生物工程中常用的双水相体系主要,有：,，,等体系。,3.,聚乙二醇（,PEG,）,/,葡聚糖（,Dex,）体系的相图是一条双节,线。双节线 下方为,，双节线上方即,为,，两相分别有不同的组成和密度。上相主要,含,，下相主要含,。,4.,在恒温恒压条件下，影响物质在聚乙二醇（,PEG,）,/,葡聚糖（,Dex,）双水相体系中分配的因素有哪些,?,分配系数,K,分别怎,样变化,?,5.,请自行设计双水相提取胞内酶的操作流程及操作要点。,