酶的抑制剂与激活剂

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,酶的抑制剂与激活剂,授课教师:,余子全,研 究 生:,贾亮 何恋,一,.,目的与内容,目的：学习研究酶的抑制剂和激活剂的方法，并通过几种金属离子和表面活性剂对枯草杆菌碱性蛋白酶活力的影响，筛选出该酶的某些抑制剂和激活剂。,内容：,1.,几种金属离子,Ca,2+,、,Ag,+,、,Cu,2+,、,Hg,2+,和,Mg,2+,对枯草杆菌碱性蛋白酶活力的影响；,2.,洗衣粉对枯草杆菌碱性蛋白酶活力的影响。,二,.,基本原理,酶分子与配体结合后，可以改变酶的活性。使酶活性降低乃至完全丧失活性的配体，称为酶的抑制剂；能启动和（或）增强酶的活性，称为酶的激活剂。研究酶的抑制和激活作用，具有重要的实用价值。,抑制剂或激活剂的作用部位，主要是酶的活性中心的必要基团或直接影响酶的结构残基所引起的效应。,本实验所用的是枯草杆菌碱性蛋白酶，该酶是由地衣芽孢杆菌经深层发酵提炼所得，能将大分子蛋白质水解成游离的氨基酸等产物，最适,pH,值一般为,9-11,，最适温度为,40-50,。,Folin,-,酚法,测碱性蛋白酶酶活原理,Folin,-,酚试剂在碱性条件下，其,磷钼酸盐,-,磷钨酸盐,易被酚类化合物还原而呈蓝色反应,(,钼蓝和钨蓝的混合物,),。,在一定浓度范围内，蓝色深浅与含酚羟基氨基酸,(,酪氨酸,),的量成正比，通过比较加入金属离子,(,或洗衣粉,),后和未加入金属离子,(,或洗衣粉,),的反应酶液的,OD,680,值，可以推断出该种金属离子是该酶的激活剂还是抑制剂。,三,.,器材和用具,1.,恒温水浴锅，试管，,722,紫外可见分光光度计，移液枪，,EP,管，试管架。,2.,试剂：,20mM/L,氯化钙，,20mM/L,硝酸银，,20mM/L,硫酸铜，,20mM/L,氯化汞，,20mM/L,氯化镁，,0.6,洗衣粉，,0.4 mol/L,碳酸钠，,2,酪蛋白，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶,(,稀释,2000,倍,),，福林,-,酚,(,市售福林,-,酚试剂加水稀释,1,倍，约为,1 mol/L),，,0.5M/L,氢氧化钠，,pH10,硼砂缓冲液，,pH7,磷酸缓冲液，,10%TCA,。,四,.,操作步骤,1,金属离子对酶活力的影响：,(1),分别将,1ml pH 10.0,酶液与相应体积的氯化钙、硝酸银、硫酸铜、氯化汞、氯化镁溶液混合，使反应液中金属离子终浓度分别为,0.8 mmol/L,和,0.4mmol/L,。,(2),混合液及,pH10,原酶液、,pH10,空白,(,共,12,支,)25,放置,20 min,。,(3),将混合液预热至,40,，加入预热的,2%,酪蛋白溶液,1 ml,，于,40,反应,10 min,。,(4),反应结束时加入,10%,三氯醋酸溶液,2 ml(,终止反应,),，立即摇匀，静置,10 min,。,(5),各取上清,1.5ml,于,EP,管中，,6000rpm,离心,1min,。取上清,1ml,于试管中，各加入,0.4 mol/L Na,2,CO,3,溶液,5ml,及福林一酚试剂,1 ml,，置于,40,显色,15 min,。,(6),测定,OD,680,值,，并以原酶活力为,100,，算出相对酶活。空白试验时，先加三氯醋酸溶液，再加入酶液和底物，同样测定,OD,680,值。,2,洗衣粉对酶活力的影响：,(1),分别在,pH 7.0,和,pH 10.0,酶液中加入洗衣粉,(,反应液终浓度为,0.03%),。,(2),混合液和,pH7,原酶液、,pH7,空白,(,共,4,支,),于,25,下放置,20 min,。,(3),测酶活力，并以原酶活力为,100,，算出相对酶活。,五,.,注意事项,1.,实验中，以先加,TCA,的酶液为空白，以原酶液试管为,标准液，对其操作应与实验试管同步一致。,2,.,由于分光光度计比较精密，所以往试管中加药品的,时候要尽量做到准确。,3.,拿比色皿是要拿它的毛面，不可以用手接触它的光滑,面；擦拭比色皿要顺着一个方向擦。,4.,在比色皿中装入的液体量大约是比色皿体积的三分之二。,六,.,实验报告,将实验结果填入下表中。,表,1,金属离子对酶活力的影响,金属离子,剩余活力,相对活力,Ca,2+,0.8 mmol/L 100,0.4mmol/L 100,Ag,+,0.8 mmol/L 100,0.4 mmol/L 100,Cu,2+,0.8 mmol/L 100,0.4mmol/L 100,Hg,2+,0.8 mmol/L 100,0.4 mmol/L 100,Mg,2+,0.8 mmol/L 100,0.4 mmol/L 100,表,2,洗衣粉对酶活力的影响,剩余酶活 相对酶活,标,准,pH7.0,酶,100,pH10.0,酶,100,洗,衣,粉,pH7.0,酶,100,pH10.0,酶,100,八,.,问题与思考,1.,根据你的实验结果，上述实验因子哪些是枯草杆菌碱性蛋白酶的抑制剂，哪些是激活剂？,2.,用何方法可以解除或避免金属离子对酶的抑制作用？,3.,查阅文献，试对你的实验结果作出机理上的可能解释。,