第三节基因工程中的酶

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,第三节基因工程中的酶学,关键词：,了解各种酶在基因工程中的作用,掌握限制性内切酶和连接酶的基本特性,逆转录酶在基因工程中参与了哪些反应？,1,2,重组,DNA,技术中常用的工具酶,工具酶,功能,限制性核酸内切酶,DNA,连接酶,DNA,聚合酶,I,反转录酶,多聚核苷酸激酶,末端转移酶,碱性磷酸酶,识别特异序列，切割,DNA,催化,DNA,中相邻的,5,磷酸基和,3,羟基末端之间形成磷酸二酯键，是,DNA,切口封合或是,DNA,片段连接,合成双链,cDNA,的第二条链,缺口平移制作高比活探针,DNA,序列分析,填补,3,末端,合成,cDNA,代替,DNA,聚合酶,I,进行填补，标记或,DNA,序列分析,催化多聚核苷酸,5,羟基末端磷酸化，或标记探针,在,3,羟基末端进行同质多聚物加尾,切除末端磷酸基,3,第一 限制性核酸内切酶,这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶。,是一类能够识别双链,DNA,分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割,DNA,双链结构的核苷酸内切酶。,4,一、限制性内切酶概念的提出,寄主控制的限制（,restriction,）与修饰,(modification),现象：,人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（,R/M,体系）。,细菌的,R/M,体系类似于免疫系统，能辨别自身的,DNA,与外来的,DNA,，并能使后者降解掉。,5,为什么生物体产生的限制酶，不会损失自身的,DNA,呢？,6,R/M,体系：,寄主是由两种酶活性配合完成的,一,种是修饰的甲基转移酶,另,一种是核酸内切限制酶,7,E.,coli,B,含有,EcoB,核酸酶,和,EcoB,甲基化酶,以,(k,),噬菌体侵染,E.,coli,B,为例,8,限制性内切酶将侵入细菌体内的,外源,DNA,切成小片断。,（,1,）限制（,Restriction,）,9,细菌自身的,DNA,碱基被,甲基化酶,甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。,（,2,）修饰（,Modification,）,Dam,甲基化酶,G,A,TC,腺嘌呤,N6,位置引入甲基,Dcm,甲基化酶,C,C,AGG,或,C,C,TGG,序列在第二个,C,上,C,5,位置上引入甲基,10,11,R/M,体系的作用：,保护自身的,DNA,不受限制；,破坏外源,DNA,使之迅速降解,12,切割不同来源的,DNA,分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“,分子手术刀,”）。,13,I,型限制性内切酶,目前鉴定出,三种不同类型,的限制性内切酶。,二、限制性内切酶的类型,II,类限制性内切酶,III,类限制性内切酶,不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。,基因工程的工具酶,切割位点不在识别位点，一般离识别位点,25bp,27bp,，对分子克隆操作亦无实用意义,14,首先由,H.O.Smith,和,K.W.Wilcox,在,1970,年从流感嗜血菌中分离出来。,（,1,）识别位点序列,未甲基化修饰,的,双链,DNA,上的特殊靶序列（多数是回文序列）。,II,类限制性内切酶,分离的第一个酶是,Hind,15,（,2,）切割位点,切开,双链,DNA,。形成,粘性末端,（,sticky end,）或,平齐末端,（,blunt end,）。,识别位点处。,16,EcoR,V 5-,GAT,ATC,-3,3-,CTA,TAG,-5,产生平齐末端,（,3,）平末端（,blunt end,）,两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心,这样形式的断裂是形成具有平末端的,DNA,片断。不易重新环化。,17,两条链上的断裂位置是交错地，但又是围绕着一个对称结构中心，这样形成的断裂结果形成具有粘性末端的,DNA,片段,（,4,）粘性末端（,sticky ends,，,cohensive,ends,）,18,含有几个核苷酸,单链,的末端。,分两种类型：,5,端凸出（如,EcoR,I,切点）,G,AATTC,CTTAA,G,G,AATTC,CTTAA,G,5,-,-3,3,-,-5,5,-,-3,3,-,-5,3,-,5,-,19,CTGCA,G,3,端凸出（如,Pst,I,切点）,G,ACGTC,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCA,G,G,ACGTC,5-,3-,20,与,DNA,结合的限制性内切酶,BamH,1,的结构。限制性内切酶识别双链,DNA,序列,5-GGATCC-3,，并在两个,GG,残基之间切开磷酸二酯键。这个切割形成带有两个有,5,粘性末端的,DNA,片段。这种蛋白质是有相同的亚基组成的二聚体。,21,连接便利,（,5,）粘性末端的意义,i,）不同的,DNA,双链：,只要粘性末端碱基互补就可以连接。,ii,）同一个,DNA,分子内连接：,通过两个相同的粘性末端可以连接成,环形分子,。,这比连接两个平齐末端容易的多。,22,23,补平成平齐末端,5,末端标记,凸出的,5,末端,可用,DNA,多核苷酸激酶进行,32,P,标记。,粘性末端可以用,DNA,聚合酶补平成平齐末端。,24,同位酶是具有相同的识别序列，但酶切位点不同的酶,如,Sma,I,和,Xma,I,的识别序列为,5-CCCGGG-3,但酶切位点不同。,Sma,I 5-C,CCGGG-3,Xma,I 5-CCCGGG-3,同位酶,25,同裂酶（,Isoschizomers,）,有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端,Example:,限制酶,Hpa,和,Msp,是一对同裂酶,(CCGG),，,5 C.CGG 3 3 GGC.C 3,26,同尾酶（,Isocaudamer,）,这一类的,限制,酶来源各异，识别的靶,序列,也不相同，但产生相同的粘性末端。由同尾酶产生的,DNA,片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的,BamH,G,GATC,C,B,cl,T,GATC,A,C,CTAG,G A,CTAG,T,27,从细菌,DNA,环化现象推测，必定存在一种能把两条,DNA,双链连接到一起的酶。,第二,DNA,连接酶,一、,DNA,连接酶（,ligase,),的发现,DNA,复制一定有断口。,基因的“针线”,28,DNA,连接酶,在一条,DNA,链的,3,末端具有一个游离的羟基（,-OH,），和在另一条,DNA,链的,5-,末端具有一个磷酸基团（,-P,）的情况下，能够催化在两条,DNA,链之间形成的磷酸二酯键,29,（,1,）大肠杆菌连接酶,1.,两种,DNA,连接酶,只能连接,粘性末端。,二、,DNA,ligase,的特点,（,2,）,T4,噬菌体的连接酶,不但能连接粘性末端，,还能连接,齐平末端,。,30,（,1,）必须是两条,双链,DNA,或,DNA-RNA,。,（,2,）,DNA3,端有游离的,-OH,，,5,端有一个磷酸基团（,P,）。,（,3,）需要,能量,动物或噬菌体中：,ATP,大肠杆菌中：,NAD,+,2.,连接条件,31,3.DNA,连接酶的基本性质,32,DNA,连接酶的基本性质,33,连接酶反应的最佳温度是,37,C,。,三、连接反应的温度,1.,最佳温度,但在,37,下,粘性末端,的结合很不稳定。,2.,实用温度,所以一般采用,416,C,。,34,第三,DNA,聚合酶,一、基因工程中常用的,DNA,聚合酶,大肠杆菌,DNA,聚合酶,2.,Klenow,fragment,3.T7 DNA,聚合酶,4.T4 DNA,聚合酶,5.,修饰过的,T7 DNA,聚合酶,6.,逆转录酶,35,二、,DNA,聚合酶在基因工程中的用途,1.,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,（,1,）大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,的性质,一条,单链多肽,。,5,3,外切酶活性位于,N,端。,3,5,的核酸外切酶活性,5,3,的,DNA,聚合酶活性,36,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,的基本用途,53,的,DNA,聚合酶活性,37,2.,Klenow,fragment,用枯草杆菌蛋白,酶处理大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,可以,切掉,N,端的,5,3,外切酶活性,部分。就成为,Klenow,fragment,。,具有,5,3,聚合酶活性和,3,5,外切酶活性。（,失去了,5,3,外切酶活性,）。,（,1,）,Klenow,fragment,的性质,38,3,端补平,补平限制性内切酶切后形成的,3,隐蔽端,。,（,2,）主要用途,3,3,39,DNA 3,末端标记,在,3,隐蔽端,加上放射性标记的,dNTP,。,40,3.,逆转录酶,最普遍使用的是来源于,鸟类骨髓母细胞瘤病毒,（,a,vian,m,yeloblastosis,v,irus,AMV,）：,依赖,RNA,的,DNA,聚合酶（,RNA,指导的,DNA,聚合酶）。,来源,RNA,肿瘤病毒。,41,逆转录酶的用途,以,oligo,dT,为引物（与,mRNA,的,polyA,尾巴互补结合）。,42,43,第四,、碱性磷酸酶,1.,碱性磷酸酶种类,从大肠杆菌中分离出来。,B,acterial,a,lkaline,p,hosphatase,，,BAP,（,1,）细菌性碱性磷酸酶,（,2,）小牛肠碱性磷酸酶,C,alf,i,ntestinal alkaline,p,hosphatase,，,CIP,从小牛肠中纯化出来。,具有抗热性。,SDS,中加热,68,o,C,可完全失活。,44,其用途是：除去,DNA,片段的,5-,磷酸，以,防止自身环化。,45,第五,、,T4,多核苷酸激酶,1.,来源,从,T4,感染大肠杆菌细胞中分离出来。,2.,功能,催化,磷酸从,ATP,转给双链或单链,DNA,或,RNA,的,5,-OH,端。,不论,5,-OH,端突出与否。,46,该酶的用途是：为化学测序法标记,DNA,的,5,末端；,47,小结,1.,限制性内切酶：,切割,2.DNA,连接酶：主要是连接,DNA,片段之间的磷酸二酯键，起,连接,作用，在基因工程中起作用。,3.DNA,聚合酶：主要是连接,DNA,片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在,DNA,复制,中起作用。,48,