真菌药敏试验操作课件

,#,侵袭性真菌药敏试验操作标准,王,瑶 北京协和医院检验科,2019,年,3,月,8,日,真菌药敏试验指南,C,L,SI,M2,7,-,A,3,酵母菌肉汤稀释法,M2,7,-S,4,QC&,B,P,s,M3,8,-,A,2,丝状真菌肉汤稀释 法,M4,4,-,A,2,酵母菌纸片扩散法,M4,4,-S,3,QC&,B,P,s,M5,1,-,A,丝状真菌纸片扩散 法,M5,1,-S,1,Q,C&,E,C,V,s,EU,CA,S,T,E.DE,F,7.,2,酵母菌肉汤稀释,法,E.DE,F,9,.1,产孢丝状真菌肉 汤稀释法,真菌临床折点,V6.1,2,微量肉汤稀释,法,-,酵母菌,酵母菌肉汤稀释,法,CLS,I,M2,7,-A3,培养基：,RPMI,1,6,4,0,0.,1,6,5,m,o,l,/L,MOPS,pH,7.0,0.1,菌株传代：沙保弱培养,基,(,SD,A,),或,土,豆培,养,基,(,P,DA),，,35,，念珠菌,24h,，隐球菌,48h,接种量：,5.,0,10,2,2.,5,10,3,CFU/,m,l,孵育条件：,35,，非新型,隐,球,菌,2,4,4,8,h,；新型隐 球菌,7,0,7,4,h,4,CLS,I,M,27-A3,酵母菌,微量肉汤稀释法判读时间和标准,5,两性霉素,B,：,2,4,或,4,8,h,，,10,0%,抑制,氟康唑、伏立康,唑,(M2,7,-,S,4,),：,24h,，,50,%,抑,制；如 生长对照生长不充分，,则,4,8,h,判读,伊曲康唑、雷伏康唑、泊沙康唑,：,4,8,h,，,50,%,抑制,5-,氟胞嘧啶：,48h,，,5,0%,抑制,棘白菌素类：,24h,，,50,%,抑制,不能,24h,读取结果的药,物,，是,由,于其,折,点按,照,48h,结果制订，或,其,24hMI,C,结果没有完成临床应,用,评,估,CLS,I M2,7,-,A,3,酵母菌,24h,与,48h,读取区别,大部分酵母,菌,MIC,在,24h,和,48h,区别很小,部分菌株，,24h,MI,C,结果与临床相关性更好,氟康唑：约,5,%,菌株在,4,8,h,产,生,严重,拖,尾现,象,，,使,24h,敏感株在,48,h,变,为,耐药,，,动物,实,验表,明,这,些菌株体内敏感。,棘白菌素类折点,按,24h,结,果制订,CLS,I,提供了,24,h,和,48,h,质控范围,6,商品化试剂盒,A,T,B,Fu,n,gus,3,改良微量肉汤稀释法,选取培养时间不超,过,4,天的纯培养菌落，如培养物不纯应 进行分纯后检测,制备,2,M,cF,菌液,将,2,0,l,菌悬液加入,A,T,B,F,2,培养基的安瓿中,用无菌吸管轻轻吹吸混,均,，尽量避免产生气泡,在每个杯状凹槽中加,入,1,3,5,l,混匀的,A,T,B,F,2,培养基,35,2,环境中，念珠菌属培,养,2,4,h,2h,，新型隐球菌培 养,48,h,6,h,A,TB,Fungus,3,操作视频,.,m,o,v,A,TB,Fungu,s,3,判读规则,8,与生长对照相比,生长不减少,4,分,生长稍减少,3,分,生长明显减少,2,分,很微弱生长或管壁周围生,长,=,1,分,不生长,0,分,唑类药敏易出现拖尾，机读易产生,假,耐药,结,果，应进行人工较正,A,TB,F,u,ngus,3,结果展示,.,m,o,v,商品化试剂盒,-,Y,ea,s,tOne,色原度物法,M,I,C,判读,加入,Alama,r,蓝,蓝色（阴性）,红色（阳性）,两性霉素,B,其它药物,9,P,OS,微量肉汤稀释,法,丝状真菌,丝状真菌肉汤稀释,法,CLS,I,M3,8,-,A2,11,培养基,RP,M,I,1640,0.165,m,ol/L,M,O,PS,pH,7,.,0,0.1,菌株传代,非皮肤霉菌,PDA,35,结合菌、曲霉,48h,；,镰刀菌,35,48,72h,然后在,25,28,培养至,7d,皮肤霉菌,PDA,；燕麦琼脂（仅红色毛,癣,菌,),30,4,5d,至产孢良好,接种量,0.5,10,4,5,10,4,C,FU/,m,l,1,10,3,3,10,3,C,FU/,m,l,孵育条件,链格孢属,30,；,35,其它,35,。,培养至产孢良好,根霉,21,26h,；,镰刀菌属、曲霉属、申克氏孢,子丝菌,46,50h,赛多孢属,70,74h,非皮肤丝状真菌孢子菌悬液的制备,接种物：分生孢子或孢囊孢子菌悬,液,0.4,10,4,5,10,4,C,F,U/,m,l,，重复性好,诱导产孢：大部分霉,菌,P,D,A,培,养,基,3,5,2C,7,d,或至产孢良好，毛霉,和曲霉,48h,，镰,刀,菌属,35,2,C,4,8,72,h,然后,28,3,0,2,C,培养到,第,7,天,。,1,m,l,0,.,8,5,%,盐水，可加,入,1,滴,or,0,.0,1,m,l,吐温,2,0,，尽,量,去除,菌,丝片,段,。,静置,35,m,i,n,，取上清转移至,无,菌管,，,振,荡,15,s,（,注,意气,溶,胶）,使用光线路径,1c,m,比色杯，测,定,530n,m,光密度：,曲霉、拟青霉,0.090.1,3,，,镰刀菌、毛霉、波氏假阿什利霉、多育赛多孢,0.150.1,7,，,链格孢、离蠕,孢,0.25,0.3,悬液,1:5,0,稀,释,，达到,最,终要,求,浓度,的,2,倍,CLS,I,M3,8,-,A,2,丝状真菌肉汤稀释法,13,丝状真,菌,M38,-A2,判读标准,非皮肤霉菌,皮肤霉菌,和时间,两性霉素,B,：,100%,两性霉素,B,：,100%,氟康唑、氟胞嘧啶、酮康,氟康唑、氟胞嘧啶、酮康唑：,唑：,50,%,抑制,80,%,抑制,伊曲康唑、泊沙康唑、雷,伊曲康唑、泊沙康唑、雷伏康,伏康唑、伏立康唑：,100%,唑、伏立康唑：,80,%,抑制,抑制,环吡酮胺：,80,%,抑制,棘白菌素类：,MEC,灰黄霉素,：,80%,抑制,曲霉、宛氏拟青霉：,2,1,2,6h,特比萘芬：,80,%,抑制,赛多孢菌属：,4,6,7,2h,或至产孢良好第一天,CLS,I,M3,8,-,A,2,棘白菌素类,M,E,C,判读,最低有效浓度,（,M,E,C,）：棘白菌,素,-,曲霉,与不含药物的生长对照相比，能够,导,致菌,丝,形 成小的、圆形的、紧凑的菌丝颗粒,的,最低,药,物,浓度,MEC,异常的,14,卡泊芬净,M,E,C,判读,生长对照,黑曲霉,黄曲霉 土曲霉,烟曲霉,15,浓度梯度稀释,法,-ET,E,S,T,酵母菌,Et,e,s,t,药敏试验方法,17,酵母菌,E,t,e,s,t,操作视频,.,m,o,v,培养基,RPMI,1,6,4,0,+,2%,葡萄糖,+,3,.45,%,MOP,S,+,1,.5%,Bact,o,琼脂,，,pH,7.0,0.1,接种量,念珠菌：,0,.,5,M,c,Farla,n,d,新型隐球菌：,1,M,c,Farla,n,d,孵育条件,念珠菌：,35,，,2,4,4,8h,新生隐球菌：,35,，,4,8,7,2h,判读方法,两性霉素,B,：,100,%,抑制 氟胞嘧啶：,90,%,抑制 唑类：,80,%,抑制 卡泊芬净：,80,%,抑制,念珠菌,Et,e,s,t,判读,100,%,抑制,酵母菌,E,t,e,s,t,结果展示,.m,o,v,80,%,抑制,18,丝状真,菌,E,t,e,s,t,方法,19,曲霉,E,t,e,s,t,操作视频,.,m,o,v,培养基,RPMI1640+,2,%,葡萄,糖,+3.45,%,MOPS+1.5%,Bac,t,o,琼脂,，,pH,7,.0,0,.1,接种量,曲霉,：,0.5,M,c,Fa,r,l,a,nd,镰刀菌和根霉,：,1,M,c,Fa,r,l,a,nd,孵育条件,曲霉,：,3,5,，,1624h,镰刀菌：,3,5,2448,h,，然后再室温孵,育,2448h,根霉,：,1624h,其它：延长孵育，每天观察至出现抑菌圈,判读方法,两性霉,素,B,：,100,%,抑制 唑类,：,80%,抑制,烟曲霉,Et,e,s,t,结果判读,100%,抑制,80%,抑制,纸片扩散法,CLS,I,M,44-A2,酵母菌纸片扩散法,纸片扩散法适用于水溶,性,抗菌,药,物，,如,氟 康唑、伏立康唑,原理：,含有定量抗菌药物的纸片,0.5,%,甲基美,蓝,+2%,葡,萄,糖,M-,H,琼脂平板,药物在纸片周围区域扩散形成递减,的,梯度,浓,度,22,CLS,I,M,44-A2,酵母菌纸片扩散法,23,培养基,M,H,琼脂,+2,%,葡萄糖,+0.5u,g,/,m,l,美,兰,，,pH,7.27.4,药物,25,g,氟康唑、,1,g,伏立康唑、,5,g,卡,泊芬净,菌株传代,血琼脂或沙保弱培养基，,35,2,，,念珠菌 培养,24h,接种量,0.5M,c,Farl,a,nd,（,1,10,6,5,10,6,CF,U,/,m,l,）,孵育条件,35,2,，,2024h,仅在菌落生长不充分时，,48h,判读,判读方法,量取菌落明显减少处抑菌圈直径，,忽,略抑菌,圈内少量菌落生长,CLS,I,M,44-A2,酵母菌纸片扩散法,读取抑菌环直,径,mm,除两性,B,读取,100,%,抑 制，其它药物读取明 显抑制处,在抑菌环内个别细小,或等大小的菌落，可忽略不计,24,CLS,I,M51,-,A,丝状真菌纸片扩散法,25,适于侵袭性感,染,丝状真菌,链格孢属、曲霉属、镰刀菌属、拟,青,霉属,、,根 霉属及其它接合菌、波氏假,阿,什利,霉,、多,育,赛,多孢等,不适于皮肤丝状真菌,不适于双向真菌,无临床折点，仅,有,E,CV,CLS,I,M51,-,A,丝状真菌纸片扩散法,26,培养基：不补充钙、镁,的,MH,培养基，,pH7.,2,7.4,接种物：分生孢子或孢囊孢子菌悬,液,0.4,10,6,5,10,6,C,F,U/,m,l,，重复性好,诱导产孢：大部分霉,菌,P,D,A,培,养,基,3,5,2C,7,d,或至产孢良好，毛霉 和曲霉,48h,，镰,刀,菌属,35,2,C,4,8,72,h,然后,28,3,0,2,C,培养到,第,7,天,。,1,m,l,0,.,8,5,%,盐水，可加,入,1,滴,or,0,.0,1,m,l,吐温,2,0,，尽,管,去除,菌,丝片,段,。,静置,3,5,m,in,，取上清转移至,无,菌管,，,振,荡,15,s,（,注,意气,溶,胶）,使用光线路径,1c,m,比色杯，测,定,530n,m,光密度：,曲,霉、,拟,青霉,0,.,0,9,0.,1,3,，,镰,刀菌,、,毛霉,、,波氏,假,阿什,利,霉、,多,育赛,多,孢,0,.,1,5,0.17,，,链,格孢,、,离蠕,孢,0.2,5,0,.,3,CLS,I,M5,1,-A,丝状真菌纸片扩散法,27,孵育时间：到生长良好,毛霉,1624,h,；,黄曲、黑曲、烟,曲,24h,，,其它,曲,霉,4,8,h,；,链格孢、离蠕孢、拟青霉、,波,氏假,阿,什,利,霉、,多育赛多孢,48,7,2,h,除两性霉素,B,外，判读,80,%,抑制,，,抑菌,圈,内 轻度拖属或有菌丝长入,抑,菌圈,，,均可,忽,略,CLS,I,M5,1,-A,丝状真菌纸片扩散法,黄曲霉,28,小结,选择适合的药敏试验方法后，认真,研,究相,应,指南,或产品说明书的操作要求，严格执,行,！,注意培养物孵育时间,注意不同菌属接种量,注意不同菌属药敏孵育时间,注意不同药物采用不同检测方法时的判读标准,严格质控，质控株检测结果也是培,训,判读,标,准的 好教材！,切勿想当然操作，做错不如不做！,Than,k,s,w,w,w,.p,um,c,h,.,cn,PE,K,I,N,G,UN,ION,M,E,D,I,C,AL,C,OL,L,E,G,E,H,O,S,PI,T,AL,P,EK,IN,G,UN,I,O,N,M,E,D,I,C,A,L,C,O,L,L,EG,E,H,O,SP,IT,AL,