单细胞凝胶电泳--课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,ppt课件,*,实验十七 单细胞凝胶电泳技术,丁书茂,单细胞凝胶电泳技术,丁书茂,1,ppt课件,单细胞凝胶电泳技术,(single cell gel electrophoresis,SCGE),，也称彗星试验,(,comet assay),，是,Ostling O,和,Johanson,KJ,首次提出，后经,Singh,等进一步完善的一种在单个细胞水平上检测,DNA,损伤、交联和修复的方法。因其简单、灵敏、低耗、快速等优点而广泛应用于生物检测、遗传毒理、流行病学调查等诸多方面。,2,ppt课件,一、实验原理,DNA,链多为磷酸复合物，在生理条件下,DNA,的多聚核酸链多呈阴离子状态,，,当外源性因素（如紫外照射）造成,DNA,链断裂时，负超螺旋结构变得松散，那么在电场作用下,DNA,就会以一定速率向正极移动。,在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等结构受到破坏，胞内蛋白质、,RNA,及其它成分均扩散到溶液中，而核,DNA,由于分子量大而只能留在原位。,3,ppt课件,经碱处理和在碱性电解质的作用后，,DNA,解旋，损伤的,DNA,断链及其片段会被释放出来，而在电泳条件下，,DNA,片段可进入凝胶孔隙发生迁移。由于这些,DNA,分子量很小，所以在电泳过程中会离开核,DNA,向正极移动，形成彗星状的图像。,在一定条件下，,DNA,迁移距离和,DNA,含量分布与,DNA,损伤程度呈线性相关。随着,DNA,损伤程度加剧，断片数目增加，表现为尾部,DNA,含量增加，彗尾延长，荧光强度加强。,4,ppt课件,二、实验流程,采用碱性,SCGE,，其基本操作过程包括：,5,ppt课件,1.,细胞制,取,取处于对数生长期的,Hela,细胞，吹打为单细胞悬液，用,PBS,调节细胞密度为,10,5,-10,6,个,/,ml,。,6,ppt课件,2.,细胞染毒,染毒组：取,1ml,细胞悬液加入,10,-3,M H,2,O,2,溶液,50l,，混匀，,37,水浴,30,min,；,阴性对照组：取,1ml,细胞悬液加入,50l PBS,缓冲液，同等条件下水浴,30,min,。,7,ppt课件,3.,制,片,第一层胶：在完全磨毛的载玻片上铺,180L,质量分数为,1%,的正常熔点琼脂糖,(,NMA,),，室温固化,10,min,；,可将玻片用吹风机稍微加热，以延缓琼脂糖凝固。,8,ppt课件,第二层胶：取,50L,质量分数为,0.8%,的低熔点琼脂糖（,LMA,）和,30L,的细胞悬液，混匀后滴加于第一层胶上，加该盖片使其均匀铺开，,4,凝固,10min,；,9,ppt课件,第三层胶：移开盖片，滴加,100,L,质量分数为,0.5%,的,LMA,于第二层胶上，加盖片，,4,凝固,10,min,。,10,ppt课件,4.,裂解,将制好的凝胶放入,冷的,裂解液中，,4,下裂解,2,小时；,裂解液使用时新配,(,铺完第二层胶后即可配制,),90,ml lysis,solution,10ml DMSO,1ml Triton-X100,11,ppt课件,5.,解旋,从裂解液中将载玻片取出，在蒸馏水中洗去过多盐，晾干。,将新配制的电泳缓冲液倒入电泳槽中，约覆过载玻片,0.25cm,，盖上盖子，在高,pH,电泳缓冲液中放置,20 min,以便,DNA,解螺旋。,12,ppt课件,6.,电泳,室温下调节缓冲液液面高低，于,20V,，,200mA,下电泳,20,min,。,13,ppt课件,7.,中和,将凝胶浸入,0.4,M Tris,缓冲液（,pH7.5,）中，浸洗,30,min,。,14,ppt课件,8.,染色观察,用,20g/L,的吖啶橙染色,3,5min,，用双蒸水洗掉表面的染料，,24,小时内在荧光显微镜下观察。,15,ppt课件,三 结果观察,16,ppt课件,17,ppt课件,18,ppt课件,四 注意事项,实验操作均在红光或暗处条件下进行，以避免造成,DNA,的额外损伤。,关键步骤是铺胶，尤其是第一层胶，一定要平整，均匀。若有气泡，用下一层胶填平。,配制裂解液时，,DMSO,为致癌剂，注意安全。用去尖的枪头取,Triton-X100,19,ppt课件,五 思考题,试分析三层胶浓度不同的原因。,试分析影响单细胞凝胶电泳实验结果的因素。,20,ppt课件,