生物化学-第二章蛋白质

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 蛋白质,(,Protein),化学,蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的,结构,物质和功能物质,。,蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程,。,学习目的与要求,:,1.,蛋白质化学的基本组成单位。,2.,氨基酸的结构、性质及分离测定方法。,3.,肽及其结构。,4.,蛋白质的结构，性质，功能及分离纯化与测定 原理方法。,重点,1.,氨基酸的结构及性质。,2.,蛋白质的结构、性质、功能。,3.,氨基酸及蛋白质的分离测定方法。,难点,1.,氨基酸的两性性质。,2.,蛋白质一级结构的测定,3.,蛋白质的二级结构的要点,4.,蛋白质结构与功能的关系。,1.,蛋白质是生物体内的结构高分子,蛋白质占干重 人体中（中年人）,人体,45%,水,55%,细菌,50%80%,蛋白质,19%,真菌,14%52%,脂肪,19%,酵母菌,14%50%,糖类,1%,白地菌,50%,无机盐,7%,第一节 蛋白质导言,一、蛋白质是生命的物质基础,2.,蛋白质是一种生物体内的功能高分子,（,1,）酶的催化作用,（,2,）调节作用,(,多肽类激素,),（,3,）运输功能,（,4,）运动功能,（,5,）免疫保护作用,(,干扰素,),（,6,）接受、传递信息的受体,（,7,）毒蛋白,二,.,蛋白质的元素组成,这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：,碳,5055, 氮,1517%,铁,锌,锰,钼,碘,铜等,氢,68, 硫,04,氧,2023, 磷,01%,蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。,其中氮含量较恒定，平均,16%,。一克氮,=6.25,克蛋白质。这是凯氏定氮法的依据。,三,.,蛋白质的水解,基本单位氨基酸,酸水解： 蛋白质 氨基酸,碱水解： 蛋白质 氨基酸,酶水解： 蛋白质 氨基酸,证明：氨基酸是蛋白质的基本组成单位,R,C,H,N,H,3,+,C,O,O,-,（一）氨基酸的结构通式,1.,特点,氨基酸的结构决定了有如下特点：,具有酸性的羧基和碱性的氨基,-,碳为手性碳原子,由于,R,侧链不同,或,分子型,离子型,2.,非蛋白氨基酸,N,H,2,C,H,2,C,H,C,O,O,H,C,H,2,C,H,2,N,H,2,C,O,N,H,C,H,2,C,H,C,O,O,H,C,H,2,O,H,N,H,2,高丝氨酸：,-,丙氨酸：,-,氨基丁酸：,鸟氨酸：,瓜氨酸：,HO,N,COOH,H,高半光氨酸：,HS-CH,2,-CH,2,-CH-COOH,NH,2,4-,羟脯氨酸：,胱氨酸：,H,2,N-CH-CH,2,-S-S- CH,2,-CH-NH,2,COOH COOH,4-,羟赖氨酸：,H,2,N-CH,2,-,CH-CH,2,-CH,2,-CH -,COOH,OH,NH,2,中性,AA,（,15,种）,（,1,）按,R,基团的酸碱性分类 酸性,AA,（,Glu,，,Asp,）,碱性,AA (His,Arg,Lys,),（,2,）按,R,基团的 疏水性,R,基团,AA,极性分类 不带电荷极性,R,基团的,AA,亲水性,R,基团,AA,正电荷,带电荷,R,基团的,AA,负电荷,脂肪族,AA,（,3,）按,R,基团的 芳香族,AA,化学结构分类 杂环族,AA,杂环亚,AA,（二）,.,氨基酸的分类,第二节 氨基酸的性质,一、氨基酸的光学活性和光吸收性质,CHO,C,HO,H,C,H,2,O,H,L,（,-,）,甘油醛,L,氨基酸,CHO,C,H,O,H,C,H,2,O,H,D,（,+,）,甘油醛,D,氨基酸,1.,氨基酸的光学活性,酪氨酸的,max,278nm,，,278,=1.4x10,3,;,苯丙氨酸的,max,259nm,，,259,=2.0x10,2,;,色氨酸的,max,279nm,，,279,=5.6x10,3,;,2.,氨基酸的光吸收,二,.,氨基酸的解离和两性性质,氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化,(-,NH,3,+,),形式存在，羧基是以离解状态,(-,COO,-,),存在。,H,3,N-CH-COOH,R,+,H,3,N-CH-COO,-,R,+,H,2,N-CH-COO,-,R,-,p,K,1,+,H,+,H,+,-,p,K,2,+,H,+,H,+,“,+”,正离子,PH,PI,1.,两性离子,同一分子中既有带正电荷的离子又有带负电荷的离子，,这种离子称为两性离子。,2.,氨基酸的等电点,在一定的,pH,值时，氨基酸分子中氨基的离解度等于羧基的离解度时，所含的,-,NH3+,和,-,COO-,数目正好相等，净电荷为,0,。在电场中既不向正极移动，也不向负极移动，这一,pH,值即为氨基酸的等电点，简称,pI,。,在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。,3.,氨基酸的等电点的计算,H,3,N-CH-COOH,R,+,H,3,N-CH-COO,-,R,+,H,2,N-CH-COO,-,R,-,p,K,1,+,H,+,H,+,-,p,K,2,+,H,+,H,+,K,1,=,H,3,N-CH-COOH,R,+,H,3,N-CH-COO,-,R,+,*,H,+,H,2,N-CH-COO,-,R,K,2,=,H,3,N-CH-COO,-,R,+,*,H,+,K,1,*,H,3,N-CH-COOH,R,+,H,3,N-CH-COO,-,R,+,*,H,+,H,2,N-CH-COO,-,R,K,2,=,H,3,N-CH-COO,-,R,+,*,H,+,*,K,1,*,H,3,N-CH-COOH,R,+,H,2,N-CH-COO,-,R,K,2,=,H,+,*,2,等电点时：,H,3,N-CH-COOH,R,+,H,2,N-CH-COO,-,R,=,K,1,*K,2,=,H,+,2,等式两边取负对数,-logK,1,+(-logK,2,)=2(-logH,+,),pK,1,+pK,2,=2pH,侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的,pK,1,和,pK,2,的算术平均值：,pI,= (pK,1,+ pK,2,)/2,同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其,pI,值也决定于两性离子两边的,pK,值的算术平均值。,酸性氨基酸：,pI = (,Pk,-COOH,+,pK,R,-COOH,)/2,碱性氨基酸：,pI = (,pK,- NH2,+,pK,R,-NH2,)/2,pH,PI,溶液对,PI,而言偏碱 带,-,PI,与,PH,的关系,pH =PI,溶液对,PI,而言中性 不带电,pH,PI,溶液对,PI,而言偏酸 带,+,等电点等于酸性基团离解常数与碱性基团离解常数之和的一半,或等电点等于两性离子两侧离解基团离解常数之和的一半,Lys,的解离如下：,K,COOH,K,-,K,-,-,H,+,H,+,H,+,（+）,（+）,（,）,（,-,）,Asp,解离如下,:,K,-COOH,K,-COOH,K,-,H,+,H,+,H,+,-COOH,（,+,）,（,-,）,（,-,）,（,）,4.,根据滴定曲线求,pK,6.02,2.34,9.69,丙氨酸的滴定曲线,三,.,氨基酸的化学反应,1.,与甲醛反应,（,一）,.,氨基参与的反应,2.,与亚硝酸反应,R,C,H,N,H,3,+,C,O,O,-,R,C,HO,N,2,CO,2,HNO,2,+,+,+,此,反应是,Vanslyke,定氮的原理,3.,与,2,4-,二硝基氟苯（,DNFB,）,反应,4.,与异硫氰酸苯酯（,PITC,）,的反应,N,H,S,:,C,C,H,C,O,R,1,H,N,N,H,C,H,C,O,R,2,+,5.,与丹磺酰氯反应,:,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与,N-,端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰,-,氨基酸。此法的优点是丹磺酰,-,氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到,1,10,-9,mol,。,（,二）,.,羧基参与的反应,肼解反应,此,法是多肽链,C-,端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，,C-,端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与,C-,端氨基酸分离,。,（,三）,.,氨基和羧基共同参与的反应,茚三酮反应,0,0,0,0,0H,0,0H,H,2,O,0,0H,0,H,H,2,N-CH-COOH,R,NH,3,+RCHO+CO,2,0,0H,0,0H,0,0H,0,H,+,NH,3,+,0,0H,0,0H,0,=N,0,O-,O,蓝,紫色化合物,入,max,=570nm,脯氨酸，羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质,入,max,=440nm,0,0H,0,0H,C,C,C,O-,O,N,+,CO,2,HN,COOH,反应名称,反应试剂,反应基团,颜色,用途,黄色反应,浓,硫酸,+,浓硝酸,苯基、酚基,黄色,Phe,Tyr,米伦反应,硝酸汞（亚汞）,酚基,红色,Tyr,乙醛酸反应,乙醛酸,吲哚基,紫红,Trp,坂口反应,萘酚,+,NaClO,胍基,红色,Arg,福林酚反应,磷钼酸,+,磷钨酸,酚基、吲哚基,蓝色,Trp,Tyr,Pauly,反应,重氮盐,咪唑基,酚基,棕红色,桔黄色,His,Tyr,巯基反应,亚硝酸亚铁氰酸钠,巯基,红色,Cys,（,四）,R-,侧链反应,-,呈色反应,第三节,.,氨基酸的分离与测定,一,.,层析法,1.,层析法,原理,层析法是利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的,差异（如溶解度、吸附力、电荷性质等），使各组分以不同,程度分布在两个,“相”,中。,固定相：被固定在一定的支持介质上的那一相。,流动相：在支持介质上移动的那一相。,当移动相流过固定相时，在流动过程中，由于各组分在,两相中的分配情况不同，电荷或亲和力不同等，以不同的速,度移动，从而达到分离。,2.,层析,方法,根据层析法的原理,分配层析法,吸附层析法,离子交换层析法,分子筛（凝胶过滤）层析法,亲和层析法,根据层析法的支持介质不同,滤纸层析,薄层层析,薄膜层析等,离子交换层析法,凝胶过滤层析法,（,1,）滤纸层析,滤纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法，,分配定律：当一种溶质在两种一定的互不相溶或几乎互不相溶,的溶剂中分配时，在一定的温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度,比与在这两种溶剂中的溶解度比值相等。,这个比值是一个常数，称为分配系数，以,K,表示。,分配系数（,K,）,=,溶质在溶剂,A,中的浓度,溶质在溶剂,B,中的浓度,固定相,水，流动相,水饱和的有机溶剂,上行层析,层析剂,原点（点样）,溶剂前沿,层析样点,滤纸,迁移率,R,f,=,原点到层析样点中心的距离（,X,）,原点到溶剂前沿的距离（,Y,）,X,Y,影响迁移率的因素：,内因,氨基酸的性质，外因,溶剂、滤纸、温度、层析方式等。,（,2,）,.,离子交换层析,离子交换树脂是一种具有酸性或碱性基团的人工合成的高分子化合物,酸性基团,碱性基团,磺酸,基（,-,SO,3,H,）,羧酸基（,-,COOH,）,季胺基,-,N,（,CH,3,）,3,氨基（,-,NH,3,）,+,+,酸性基团,交换阳离子，碱性基团,交换阴离子,洗脱,离子交换树脂,样品,由于不同的氨基酸,PI,不同，在一定的,PH,溶液中,带电荷的性质不同，带电荷的多少不同，与不同,的离子交换树脂的结合能力不同。,洗脱时不能结合的最先被洗脱出来，结合能力,小的其次，结合能力大的最后被洗脱出来。,二,.,电泳法,1.,原理,电泳：是指带电的质点在电场中向本身电荷相反的电极移动的现象。,带电质点移动的速度与外加电场强度、质点本身所带电荷成正比。,而与介质的黏度、质点大小成反比,2.,方法,根据支持物不同可分为：,纸,电泳,薄膜电泳,薄层电泳,凝胶电泳,三,.,氨基酸含量的测定,主要根据氨基酸的化学性质及其特定的化学呈色反应来测定,1.,中和法测定氨基酸含量,2.,显色分析法,（,1,）茚,三酮,反应,（,2,）,R,基反应,显色后通过比色的方法来测定其含量。,4.,荧光分析法,与,荧光试剂反应后测定荧光强度来确定氨基酸含量（如,DNS,法）,3.,紫外分光光度法,Trp,Tyr,Phe,可用紫外法来测定,第四节 肽,一,.,肽的结构,氨基酸残基,肽,单位,二,.,生物活性肽,+,H,3,N-,Tyr,-,Gly,-,Gly,-,Phe,-Met-COO,-,Met-,脑啡肽,+,H,3,N-,Tyr,-,Gly,-,Gly,-,Phe,-,Leu,-COO,-,Leu,-,脑啡肽,H,2,N-CHCH,2,CH,2,-CO-NH-CH-CO-NH-CH,2,COOH,COOH CH,2,SH,2GSH GS-SG,1.,谷胱甘肽,2.,脑啡肽,Leu,-(D),phe,-pro-,val,-,Orn,Orn,-,val,-pro-(D),phe,-,Leu,4.,短杆菌肽,S,（,Orn,鸟氨酸）,3.,催产素与加压素,第五节 蛋白质分类,一,.,根据蛋白质分子形状分类,1.,球状蛋白,2.,纤维状蛋白,二,.,根据蛋白质的组成成份分类,1.,单纯蛋白,2.,结合蛋白,清蛋白 核蛋白,谷蛋白和醇溶谷蛋白 色蛋白,精蛋白和组蛋白 糖蛋白,硬蛋白 脂蛋白,磷蛋白,第六节 蛋白质的一级结构,一,.,蛋白质的氨基酸组成,1.,蛋白质的氨基酸组成可用残基重量百分数表示,147,165,如：,100,克胰岛素 分析得到,phe8.6,克，其重量百分数为：,残基分子量,氨基酸含量,*,=,8.6,*,=,7.7,克,氨基酸分子量,2.,根据百分组成计算氨基酸的分子个数,如：胰岛素分子量为,6000,，丙氨酸占,4.6%,，氨基酸个数为：,=,=,3,4.6%*6000,89,氨基酸的百分含量*蛋白质分子量,氨基酸的分子量,a,盐键（离子键 ）,b,氢键,c,疏水相互作用力,d,范德华力,e,二硫键,f,酯键,二,.,蛋白质分子结构中的化学键,维系蛋白质分子的一级结构：肽键,维系蛋白质分子的二级结构：氢键,维系蛋白质分子的三级结构：疏水相,互作用力,维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键、氢键、疏水相互作用力,离子键,氢键,范德华力,疏水相互作用力,氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键,氢键、范德华力虽然键能小，但数量大,疏水相互作用力对维持三级结构特别重要,盐键数量小,二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定,三,.,蛋白质一级结构的测定,（一）氨基酸组成成分分析,（二）末端分析,1.,N-,末端,2.,C-,末端,（三）肽链伸展与分离,（四）肽链部分水解与肽段分离,（五）肽段的氨基酸顺序测定,（六）由各段顺序推断的氨基酸顺序,化学法：,溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键,。,酶法,-,HN-CH-CO-NH-CH-CO,R,1,R,2,胰酶：,R,1,=,Lys,.,Arg,胰凝乳酶：,R,1,=,phe,.,Tyr,.,Trp,胃酶：,R,1,R,2,=,phe,.,Tyr,.,Trp,.,leu,嗜热菌蛋白酶：,R,2,=,phe,.,Tyr,.,Trp,.,leu,.,Ile,.,val,Glu,酶：,R,1,=,Glu,.Asp,Arg,酶：,R,1,=,Arg,第七节 蛋白质的高级结构,二级,结构,超二级结构,结构域,三级结构,四级结构,高级结构,-,螺旋,-,折叠,-,转角,自由回折,一,.,高级结构的概念,1.,-,螺旋,二,.,二级结构,要点：,螺旋的角度与高度,维持螺旋的作用力,影响螺旋稳定的因素,螺旋的种类,2. ,-,折叠,要点：,肽链的走向（,种类）,残基轴心距离,维持的作用力,影响,-,折叠,稳定的因素,3.,-,转角,4.,自由回折,氢键,180,0,的回转,O H,-C-NH-CH-CO-N-,2,R,自由回折,三,.,超二级结构, , ,四,.,三级结构,要点：,形状,折叠,作用力,蛋白质多肽链在二级或超二级,结构的基础上进一步纽曲折叠,形成很不规则但具有特定构象的,蛋白质分子。,1.,外圆中空：极性基团分布,分子的外侧，非极性基团,在分子内形成孔穴。,2.,片段折叠：片段折叠成,7-8,段，每段为螺旋结构（,75%,）。,3.,作用力：疏水力,五,.,四级结构,两条或,两条以上具有三级结构的,多肽链组合在一起形成特定构象,的蛋白质分子。,四级结构中具有三级结构的多肽,链称为亚基。亚基单独存在没有,活性。,作用力：次级键。,一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构亚基四级结构,第八节,.,个别蛋白质结构与功能,一,.,纤维状蛋白,不溶于,水,可伸缩,不被酶水解,氨基酸与球蛋白不同,胱氨酸含量,22%,主要氨基酸为甘、丙、丝,3,条右向左缠绕、直径,2,nm,二硫键维持,1.,角蛋白,2.,丝心蛋白,甘、丙、丝为,87%,不含,Cys,Gly,-Ser-,Gly,-Ala-,Gly,-Ala,六肽重复,3.,胶原蛋白,氨基酸组成：甘氨酸,35%,，丙氨酸,11%,，脯氨酸,12%,，,羟脯氨酸,9%,，少量羟赖氨酸,氨基酸排列：每间隔两个氨基酸就有一个甘氨酸，,每两个甘氨基酸间的两个氨基酸之一为脯氨酸或羟脯氨酸,胶原蛋白的分子结构单位：原胶原，原胶原分子定向排列整齐,原胶原分子大小：直径,14,，长,300,，相对分子量,36000,原胶原分子肽链组成：,3,条，每条,1000,氨基酸，每条肽链为左手螺旋，,3,条肽链相互缠绕成为右手螺旋，肽链间氢键联系,二,.,球状蛋白,1.,球状（圆形）,2.,亲水,3.,极性基团分布于分子外侧,非极性基团分布于分子内侧,三、糖蛋白,1.,糖蛋白的概念：是一类糖与蛋白质的共价键连接而成的结合物。,粘,蛋白：含氨基己糖在,4%,以上,糖蛋白：含氨基己糖在,4%,以下,糖蛋白,蛋白聚糖：含蛋白质部分很少，而且多为短肽，糖含量很高。,2.,糖蛋白的分布：动物,/,植物,/,微生物，胞内,/,胞外，组织,/,体液,如：神经组织，眼球水晶体液，眼角膜，视网膜等,3.,糖蛋白的存在形式：结合,/,可溶,如：细菌细胞壁的肽聚糖，植物的凝集素，酶等,4.,糖链：直链,/,支链，,1,个糖基,数百个糖基，同多糖,/,杂多糖,5.,单糖种类：单糖及其衍生物,10,种。,木糖、阿拉伯糖（五碳糖），,葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖（六碳糖），,N-,乙酰葡萄糖胺、,N-,乙酰半乳糖胺（氨基糖），,神经氨酸、羟乙酰神经氨酸（唾液酸）,6.,糖与蛋白质的连接方式：,N-,糖甘键：,Asn,- N-,乙酰葡萄糖胺,O-,糖甘键：,Ser- N-,乙酰半乳糖胺,Hyl,-,半乳糖,Thr,-,木糖,Hyp,-,阿拉伯糖,7.,糖蛋白的功能：催化功能,/,调节功能,/,运输功能（载体）,/,信息传递功能（受体）,/,免疫保护功能,/,细胞识别,/,其它,四、脂蛋白,1.,脂蛋白的概念：是指脂质同蛋白质以次级键结合而成的结合物,2.,脂蛋白的分布：细胞和血液,细胞脂蛋白：主要存在于生物膜，脂质主要是磷脂，其次是糖脂。,不同种属细胞脂蛋白的蛋白质和脂质在质与量上有较大差异。,血浆脂蛋白：血浆脂蛋白又称可溶性脂蛋白，在水中部分溶解。,3.,脂蛋白的种类：,-,型：密度较大，,1.063-1.21,g/,mL,电泳时同,-,球蛋白一起移动,-,型：密度较小，,1.063,g/,mL,电泳时同,-,球蛋白一起移动,根据密度大小，血浆脂蛋白可分为：,乳糜微粒（,CM,）,极低密度脂蛋白（,VLDL,）,低密度脂蛋白（,LDL,）,高密度脂蛋白（,HDL,）,极高密度脂蛋白（,VHDL,）,CM,、,VLDL,、,LDL,含有的脂质多于蛋白质,含三酰,甘油较多,含,磷脂较多,4.,载脂蛋白：脂蛋白中的蛋白质部分，,分为：,apoA,: AI,、,A,、,A,apoB,: B,48,、,B,100,apoC,:CI C,C,apoD,apoE,5,.,脂蛋白的功能：,转运脂质及固醇类物质。,CM,：,转运外源性脂肪,VLDL,：,转运内源性脂肪,LDL,：,肝胆固醇转运到肝外,HDL,：,肝外胆固醇转运到肝内,VHDL,：,转运脂肪酸,第九节 蛋白质分子结构与功能,一,.,一级结构与功能的关系,例如：,.,胰岛素的结构与功能,胰岛素为,A-B,两链由,51,个氨,基酸组成，,A,链,21,个氨基酸，,B,链,30,个氨基酸。,不变：与活性有关,6,个,Cys,的位置不变,可变：与免疫有关,常变的有,B,30,、,A,8,、,9,、,10,（,一）同功能蛋白中氨基酸,顺序的种属差异,例如,.,细胞色素,C,与生物进化,（,二）生物进化中同功能蛋白质在结构上的变化,例如,.,血红蛋白结构与功能,（,三）蛋白质结构上的变化与功能的改变,二,.,蛋白质的构象与功能的关系,（,一）,月,元病毒构象与功能的关系,（二）血红蛋白构象与功能的关系,2,，,3-,二磷酸甘油酸,（,DPG,）,O,2,O,2,O,2,O,2,O,2,影响氧与血红蛋白结合的因素：,1.,氧的分压,2.,PH-,波耳效应,3.,DPG,的浓度,盐键共八,对，,亚基间四对，,亚基内各一对，,亚基间各一对。,亚基,亚基,盐键,第十节 蛋白质的性质,一,.,蛋白质的两性解离和等电点,蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时,(,Isoelectric,point,pI,),，,蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。,在不同的,pH,环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳,(Electrophoresis),。,Pr,NH,3,COOH,Pr,NH,3,COO,_,Pr,NH,2,COO,_,+,+,pH,pI,二,.,蛋白质的分子大小,1.,根据化学成分测定最小相对分子质量,据其百分含量可计算出最低相对分子质量：,最小相对分子质量,（成分的相对分子或原子质量）,已知成分的百分含量,2.,沉降系数,一个,S,单位，为,110-13,秒,蛋白质的沉降系数：,1,200,S,，,相对分子质量越大，,S,值越大,由沉降系数,S,可根据斯维得贝格,Svedberg,方程计算蛋白质分子的相对分子质量：,M=RST/D1,i,R,：,气体常数,T,：,绝对温度,D,：,扩散系数,：,溶剂的密度,S=,dx,/,dt,2,x,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在,280,nm,附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在,280,nm,附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。,三,.,蛋白质的紫外吸收性质,蛋白质含量,OD,值,nm,280,OD值,由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。,由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,稳定因素：电荷作用，水化作用,四,.,蛋白质的胶体性质,Pr,H,2,O,H,2,O,H,2,O,H,2,O,Pr,五,.,蛋白质的沉淀作用,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关,改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质,在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,沉淀原因：破坏胶体稳定因素，变性,PI,沉淀,盐析： 加入高浓度中性盐使蛋白质从溶液中沉淀析出,有机溶剂沉淀：低浓度,-,极性有机溶剂,高浓度非极性有机溶剂,有机酸沉淀,:,重金属沉淀,:,沉淀的方法有：,蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性,.,六,.,蛋白质的变性,变性后性质的变化：,1.,溶解度下降,(,沉淀,),2.,粘度升高,3.,生物活性丧失,4.,密度升高,5.,沉降系数增大,6.,易被酶消化（水解）,七、蛋白质的颜色反应,氨基酸,蛋白质,蓝紫色,巯基,茚三酮,茚三酮反应,多肽，,Pr,紫红色,两个肽键,碱性硫酸铜,双缩脲反应,Trp,Tyr,Pr,蓝色,酚基、吲哚基,磷钼酸,+,磷钨酸,福林酚反应,Arg,Pr,红色,胍基,萘酚,+,NaClO,坂口反应,Trp,Pr,紫红,吲哚基,乙醛酸,乙醛酸反应,Tyr,Pr,红色,酚基,硝酸汞（亚汞）,米伦反应,Phe,Tyr,Pr,黄色,苯基、酚基,浓,硫酸,+,浓硝酸,黄色反应,用途,颜色,反应基团,反应试剂,反应名称,第十一节 蛋白质分离纯化及测定,一,.,蛋白质分离与纯化,的一般原则,1.,结合状态变成溶解状态释放出来,2.,防止变性并保持原有状态,3.,提高纯度和活性，祛除杂蛋白,二,.,蛋白质分离纯化的方法,根据分子大小,根据溶解性,根据电荷,根据吸附力,根据特异性亲和力,透析,/,超过,滤法,密度梯度离心法,凝胶过滤法,PI,沉淀法,盐溶和盐析法,电泳法,离子交换法,凝胶过滤法,凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构,一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外,洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大,测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：,Sephadex,电泳法,蛋白质在等电点,pH,条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化,。,(,正常人,),(+),清蛋白,1,2, ,(-),三,.,蛋白质浓度测定的方法,1.,福林试剂反应,福林试剂：磷钼酸,-,磷钨酸将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨,蓝混合物。酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应）,2.,双缩脲法,在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应 蛋白质,-,铜络合物，灵敏度提高,100,倍,3.,考马斯亮蓝,G-250,本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色，与蛋白的亲和力强，灵敏度高，,1-1000,微克,/,毫升,4.,凯氏定氮法,5.,紫外吸收法,