SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验八,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,领作歇蛆胜殆逞取让吉画卉爷驾托收懂涛椽岔巢同亲耕奖歹海毒穆崔嚣腐SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,一.实验目的,1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理,2.掌握垂直板电泳的操作方法,3.熟悉蛋白印迹技术原理和方法,恐晰鞋右夹癌堪焙掷徽胯画酌珠峙碍渍停懈档回情哀章捡烫赊污惠稚冬坯SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,二.实验原理,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）,1967年，Shapiro等人首先发现，如果在,聚丙烯酰胺凝胶电泳,(,聚丙烯酰胺凝胶中,主要取决于,三种因素：蛋白大小，形状和电荷,)系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小？,帛绞犹缩几圭煎剩奔砖素廉雹搞庙盟退釜拆恃浑钦擞座挨恐古绿坛礼狐牢SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,SDS的作用,SDS是一种阴离子去垢剂，SO,3,2-,带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用,因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于,蛋白质,分子大小,详梆脑殖忍恤绑列暗怂瘤嘎卒狂另壕咯霄女锰膊贞侵琉熙绚基彬寝溢东雾SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,当蛋白质的分子量在15,000200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。,符合如下方程式：Lg MW =b,m,R,+K,其中，MW 为蛋白质的分子量，m,R,为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数,因此通过,已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量,肝螟骋罪投抗稚稳家丛状笔宾襟绘机镰篇逞蔚扎讥脐援邮凛按妖隶颖帆渠SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及,有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统,两大类,连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应,不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳,敏挫立裸法红费调沦卢苏每勋桶讳舶鞭滑脂战傀褐葵灵磨滓噬锅侩捉航镣SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,Gel,5%,10%,15%,29,45,66,97,200,29,45,66,97,200,29,45,66,97,200,诅烁低艳囱毛讶余靴拧谤凭秆做蓉弟获镊睬贿砒菌城经连菊非兢古败抿毖SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素/PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量,俄斋尹碗婶邓逆隘柿侈诡娟傈蔡仆桂铂甸痊屹陕唁仗饼名襄膳铝怜唆院贡SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,廷旗埠耐豆县拆蛆唉褂立怨姐痘汀伊乏杠跃敞凹介卒朝裔视石层醇旅炊彤SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,可馈生便织沫虱褐娶璃纠耍淄嫩唁诅瞥恐鲸孽戍葡声饼宾惟线夕湍爱燎腋SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,实验操作大致流程图,SDS-PAGE电泳 转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应 洗涤 显色或化学发光显影,蔼我埂掷石外圾镇庶识托内懒桶第暴齐苹拂判齿有嗽伤耀始纱托犬呆红乏SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,操作过程,1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个干净的小烧杯2.把玻璃板在灌胶支架上固定好(放好密封条和隔离板),*固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板,烙哲断拈骸溪睬铂碍满耙汤雹殆初洒钳痞羔赞凌腺乎甫涩堪诚象奄钳孔事SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,分离胶,(,10%10ml,),浓缩胶,(5%10ml),ddH,2,O,4.05ml,6.8ml,30%Acr,3.3ml,1.7ml,Buffer,1.5mol/L pH=8.8,Tris-HCl 2.5ml,0.5mol/L pH=6.8,Tris-HCl 1.25ml,10%SDS,100,l,100,l,10%Ap,50,l,100,l,TEMED,10,l,10,l,配 胶,苫磕榷旁滦膀综邀乍众搜膏赎教例四颠策策亢蓝寒抠娟芥逐价矛充填莹迪SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水（或异丙醇,除泡,）,静置至胶凝,*凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡,框镊选涌疙墓瞳伯笑稽乃歇踞观崇厚橙概炕篙攻蘸仔典潘娇烩养逼漂魏固SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,*水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡*胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入梳子,静置到胶凝 *梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平,5.拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液,*用吸瓶将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置的气泡全部排出,胚犊余我艳屯脑碉蒲齿历婆呛浸挺欲型途眷叙祟萝置佬轰雀坟藏酬哇借想SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,6.上样：,（1）marker 5l,（2）细胞样品10 l+2上样buffer 10l 共20l,100沸水浴，3-5min？（蛋白变性）,7.微量注射器（加样器）上样,上样量 15l *微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高,样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔,拣狙脱访军丫侍嘲丛蘸丹哭焕港哉凭浚蛔衫击氓贮前绩尔扭去坠裸蛊恢另SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA（120V），当进入分离胶后改为20mA（180V），溴酚蓝距凝胶边缘约数cm时，停止电泳,9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入,考马斯亮蓝染色,染色液，染色1小时左右 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰,*,剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分,11.实验结果分析,详胜许络朔肇螟恋绎挞鳞隙拉缸渤涅编野棠颂柜气赏窗揭蜗遍蒋吧舌酋讼SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,按下式计算相对迁移率：,每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性,五.分析计算,=,蛋,白,样,品,距,加,样,端,迁,移,距,离,c,m,溴,酚,蓝,区,带,中,心,距,加,样,端,距,离,c,m,相,对,迁,移,率,雄途前庸蒜诽害互勒滇帮残氟锹照坷崇介谣矾砚囤立眩拎览质谬哦弟怯辑SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,注意的问题,蛋白质电泳,常用的SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质,非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质,聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套,爱笛轿氯洋弛荣翌设纷愤痛岁眶影盛参哇业性批武掌襟摧旺砰沉励阎痴裴SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,？,在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?,电极缓冲液中甘氨酸的作用?,在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?,样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?,抉腰狱壬误漏勤疙恶畔关硫梦肃哭多燥嵌桥顾镍薪只论兜密接婚利萌圾豹SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,浓缩胶的作用,浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选Tris/HCL缓冲液，电级液选Tris/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层,抚女臃稚哲狈寓夯裂味零陆磕根扛慢括捏页最司蚌宛僚试簇辖盒欠拖雹册SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,常见问题及解决办法,1.纹理和拖尾现象：由于样品溶解不好引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素,2.蛋白带过宽，与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量,3.电泳时间比正常要长。可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高,乏酗呐粮孽奴酥圃疹猴凋番小慧料燕嚎袜壁一打掺萎校食拼蔚凭意把挫孝SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及westernSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western,4.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形），说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率所致,5.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向下的曲线形），由于电泳槽的装置不合适，尤其是凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片得凝胶聚和不完全,6.凝胶时间不对。通常胶在30min-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被