血红蛋白的提取和分离讲义

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,血红蛋白的提取和分离,1凝胶色谱法,(1),概,念,也称做,，是根据,分离蛋白质的有效方法。,(2)原理,由,构成的凝胶，内部有许多贯穿的,。,血红蛋白提取和分离的基本原理,分配色谱法,相对分子质量的大小,多孔球体,通道,当,不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量,的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程,，移动速度,，而相对分子质量,的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在,移动，路程,，移动速度,，从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以,。,相对分子质量,较小,较长,较慢,较大,凝胶外部,较短,较快,分离,2缓冲溶液,(1),作,用,在一定范围内，抵制外界的,对溶液pH的影响，维持pH,。,(2)配制,由12种,溶解于水中配制而成，通过,就可以得到在不同pH范围内使用的缓冲液。,酸和碱,基本不变,缓冲剂,调节缓冲剂,的比例,3电泳,(1),概,念,指,在电场的作用下发生,的过程。,(2)原理,在一定的,下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上,或,，在电场的作用下，这些带电分子会向着,的电极移动。,带电粒子,迁移,pH,正电,负电,与其所带电荷相反,(3)作用,电泳利用了待分离样品中各种分子,的差异及分子本身的,、,的不同，使带电分子产生不同的,，从而实现样品中,。,(4)方法,常用的电泳方法有,和,。测定蛋白质分子量时通常使用,。,带电性质,大小,形状,迁移速度,各种分子的分离,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,思维激活1,凝,胶色谱法和电泳法在实现分子分离的原理方面有何不同？,提示,凝胶色谱法分离分子是依据分子质量大小，利用凝胶色谱柱使大分子优先洗脱出来，而小分子后分离出来。电泳法分离分子则是依据各种分子带电性质的差异，以及分子本身的大小，形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现在电场中将各种分子分离。,蛋白质分离的依据,蛋,白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。,(1)凝胶色谱法,相对分,子质量,直径大小,运动方式,运动,速度,运动,路程,洗脱,次序,大,大于凝胶颗粒,空隙直径、被,排阻在外面,垂直向,下移动,较快,较短,先从凝,胶柱洗,脱出来,小,小于凝胶颗粒,空隙直径，可以,进入颗粒内部,垂直向下移,动，无规则,扩散进入凝,胶颗粒,较慢,较长,后从凝,胶柱洗,脱出来,(2)电泳法,含义：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。,原理：一些生物大分子具有可解离的基团，在一定pH下，会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。因各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，迁移速度不同，从而实现各种分子的分离。,常用方法：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。在测定蛋白质的相对分子质量时，通常使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，此方法也可用来分离蛋白质混合组分(亚基)。,【巩固1】,凝,胶色谱法分离蛋白质的原理依据是()。,A根据蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小,B根据蛋白质相对分子质量的大小,C根据蛋白质所带电荷的多少,D根据蛋白质溶解度的大小,解析,凝胶色谱法所用的凝胶实际上是一些微小多孔的球体，在小球内部有许多贯穿的通道，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。,答案,B,1蛋白质的提取和分离一般分为四步,：,、,、,和,。,2,样品处理,(1),红,细胞的洗涤,采集血样，,，吸取血浆后加,洗涤，再低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色。目的是,，以利于后续步骤的分离纯化。,血红蛋白提取和分离的实验操作与评价,样品处理,粗分离,纯化,纯度鉴定,低速短时间离心,生理盐水,除去杂质,(2)血红蛋白的释放,将洗涤好的红细胞依次加入,至原血液体积、40%体积的,，置于磁力搅拌器上搅拌10 min，使红细胞吸水,，血红蛋白释放出来。,(3)分离血红蛋白溶液,将搅拌好的混合液转移到,中，以2 000 r/min的速度,10 min。使血红蛋白和其他杂质分离开，便于下一步对血红蛋白的纯化。,蒸馏水,甲苯,涨破,离心管,离心,(4)透析,取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的,中(pH为7.0)，透析12 h(以除去样品中相对分子质量较小的杂质)。,3,凝胶色谱操作,(1),凝,胶色谱柱的制作：准备材料加工橡皮塞安装,。,(2)凝胶色谱柱的装填。,(3)样品的,。,磷酸缓冲液,色谱柱,加入和洗脱,4操作提示,(1),红,细胞的洗涤,、,与,十分重要。洗涤次数过少，无法除去,；离心速度,和时间,会使,等一同沉淀，达不到分离效果。,(2)色谱柱填料的处理,商品凝胶使用前需直接放在,中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶,，加速膨胀。,洗涤次数,离心速度,离心时间,血浆蛋白,过高,过长,白细胞,洗脱液,用沸水浴加热,(3)凝胶色谱柱的装填,在装填凝胶柱时，不得有,存在。因其能搅乱洗脱液中蛋白质的,，降低分离效果。,(4)蛋白质的分离,如果,，说明色谱柱制作成功。,气泡,洗脱次序,红色区带均匀一致地移动,思维激活2,透,析的目的是什么？依据了什么原理？,提示,透析的目的在于去除血红蛋白溶液中相对分子质量较小的蛋白质，透析依据的原理是半透膜只允许小分子透过，不允许大分子透过。,1样品的处理,(1),红,细胞的洗涤,目的：去除杂蛋白。,方法,a采集血样b.低速短时间离心c.吸取血浆d.盐水洗涤e.低速离心重复d、e步骤三次。,(2)血红蛋白的释放,红细胞在蒸馏水和甲苯的作用下破裂，释放出血红蛋白。,(3)分离血红蛋白溶液,将混合液进行离心后，会明显看到试管中的溶液的分层情况(从上往下)：第1层：无色透明的甲苯层；第2层：脂溶性物质的沉淀层白色薄层固体；第3层：血红蛋白的水溶液红色透明液体；第4层：其他杂质的暗红色沉淀物。,将液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,目的：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。,(4)透析,原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。,过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。,目的：a.除去样品中相对分子质量较小的杂质；,b用于更换样品的缓冲液。,2凝胶色谱操作,3纯度鉴定SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,判,断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。,4结果分析与评价,血红蛋白,的分离,血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出,分离成功,血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽,分离效果不好，可能与凝胶色谱柱的装填有关,特别提醒SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量，是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于相对分子质量的高低，因此可从已知相对分子质量的标准蛋白质的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的相对分子质量。,【巩固2】,在,血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是()。,A防止血红蛋白被氧化,B血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和,C磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程,D让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能,解析,利用磷酸缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于分离观察(红色)和研究(活性)。,答案,D,【例1】,下,图中，可表示为相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的移动过程的是()。,血红蛋白提取和分离的基本原理,思维导图：,深度剖析,本题考查凝胶色谱法原理。根据分子筛效应可知，相对分子质量较大的蛋白质分子通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量最小的分子最后流出，故选B。,答案,B,特别提醒,血红蛋白的分离方法及相关原理比较：,方法,原理,凝胶色谱法,根据相对分子质量的大小分离蛋白质,电泳法,根据各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同进行分离,【例2】,下,图是用除去DNA的滤液进行血红蛋白的提取和分离实验的装置，下列有关叙述不正确的是()。,血红蛋白提取和分离的实验操作,A首先用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质,B图乙装置的试管中收集到的液体中最先出现的是相对分子质量较小的蛋白质,C用图乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每管收集5 mL，连续收集,D图丙装置中电泳法分离提纯血红蛋白的原理是血红蛋白带有一定量的电荷，在电场的作用下向一极移动,思维导图：,深度剖析,用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质。图乙装置表示通过凝胶色谱法分离蛋白质的过程。蛋白质的相对分子质量较大，被排阻在凝胶颗粒的外面，在颗粒之间迅速通过。,答案,B,归纳整合,蛋白质的提取和分离,步骤,操作,样品处理,通过红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液等操作收集到血红蛋白溶液,粗分离,通过透析法去除血红蛋白溶液中的相对分子质量较小的杂质,纯化,通过凝胶色谱法分离相对分子质量不同的蛋白质,纯度鉴定,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求,旁栏思考题,你,能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？,答案,凝胶,实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。,因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，影响分离的效果。,练习,1,解析,本题考查凝胶色谱法分离蛋白质的原理。该方法的原理的核心是利用了不同体积(大小)的蛋白质在凝胶中的迁移速度不同以达到分离的目的。,答案,凝,胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。,相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同相对分子质量的蛋白质分子可以获得分离。,2,答案,在,一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。,缓冲溶液通常是由一或两种化合物(缓冲剂)溶解于水中制得，调节缓冲剂的配