实验三 酵母核酸的制备及成份鉴定

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验三,酵母核糖核酸的提取及组分鉴定,(先打开水浴锅,温度设置成100摄氏度),一、目的,二、原理,三、器材,四、试剂和材料,五、操作,六、注意事项,一、目的,了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法以,了解苔黑酚定量测定,RNA,的方法。,二、原理,酵母核糖核酸中,RNA,含量较多，,RNA,可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，即得到,RNA,的粗制品。,核糖核酸中含有核糖、嘌呤碱，嘧啶碱和磷酸各组分，加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。,1.,磷酸 磷酸与钼酸铵试剂作用生成黄色磷钼酸，磷钼酸中的钼在有还原剂（,Vc,）存在时可被还原成蓝色的钼蓝。根据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在。,2.,嘌呤碱 根据嘌呤碱能与硝酸银产生灰褐色的絮状嘌呤银化合物而鉴定。,3.,戊糖 根据核糖经浓盐酸或浓硫酸作用则生成糠醛，后者能与,3,，,5,二羟甲苯缩合而形成绿色化合物而鉴定。,脱氧核糖在浓酸中生成,-,羟基,-,酮基戊醛，它和二苯胺作用生成蓝色化合物。,三、器材,锥形瓶,大研钵,电子天平,离心机,恒温水浴锅,注意仪器使用方法,离心管平衡!,四、试剂和材料,酵母粉,0.04,M,NaOH,95%乙醇,1.5,M H,2,SO,4,溶液,浓氨水,0.1,M AgNO,3,酸性乙醇溶液：30,ml95%,乙醇加0.3,ml,浓盐酸混匀。,苔黑酚-,FeCl,3,溶液：将100,mg,苔黑酚溶于100,ml,浓,HCl,中,再加入100,mgFeCl,3,.6H,2,O，,临用时配制。,定磷试剂：,按顺序以,A：B：C：,蒸馏水1：1：1：2（,V/V）,混匀,现配。,A、17%H,2,SO,4,：,将17,ml,浓硫酸缓缓加入83,ml,水中。,B、2.5%（NH,4,）,6,Mo,7,O,24,：2.5g（NH,4,）,4,Mo,2,O,7,溶于100,ml,蒸馏水中。,C、10%Vc：10g,Vc,溶于100,ml,蒸馏水中，用棕色瓶贮存。颜色呈淡黄色时可以使用，如呈深黄或棕色则失效。,五、操作,1、,酵母,RNA,的提取,(2-3人一份),将4,g,酵母溶于20,ml0.04 M,NaOH,溶液中（先以少量,NaOH,溶液湿润酵母，并充分研磨)，将悬浮液转移到250,ml,锥形瓶中，在沸水浴30分钟，不时搅拌,冷却后转入离心管进行离心.,-（蛋白质变性沉淀，,RNA,溶于碱性溶液）,离心10,min（4000rpm),将上清液倾入10,ml,酸性乙醇溶液中，待核糖核酸沉淀完全后，离心3,min（4000rpm），,弃去上清。,-,RNA,不溶于乙醇，,pI,=2.5）,用95%乙醇洗涤沉淀，离心3,min（4000rpm）,弃去上清液，共进行两次。沉淀可在空气中干燥，即为酵母,RNA,的粗制品。,五、操作,2、,RNA,水解液的制备：,取200,mg,提取的核酸，加入1.5,M H,2,SO,4,10ml，,在沸水浴中加热10分钟后制成水解液并进行组分的鉴定。,3、,RNA,组分的鉴定：,嘌呤碱：取水解液1,ml,加入约1,ml0.1 M AgNO,3,溶液,然后加入过量的浓氨水，观察溶液的变化。,核糖：取1支试管加入水解液1,ml，,加三氯化铁,-,盐酸溶液,2 ml,，再加苔黑酚溶液,0.2ml，,放沸水浴中10分钟，注意溶液颜色的变化。,磷酸：取1支试管，加入水解液1,ml,和定磷试剂1,ml，,在水浴中加热，观察溶液颜色的变化。,(,浓氨水,FeCl3-,浓,HCl,定磷试剂在通风柜中,),六、注意事项,1.,先以少量,NaOH,溶液湿润酵母，并进行充分研磨，再用剩余的,NaOH,溶液冲洗研钵一起转入离心管。,提取时,注意每个步骤的目的和意义,2.思考题：为什么提取率各组间会出现较大的差异,3.完成实验报告,