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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章,.,细胞生物学技术,西安交通大学医学院遗传与分子生物学系胡晓岩,模型生物,第一节,.,显微镜技术,一,.,显微镜与分辨率：,人的肉眼分辨率为,0.2mm,光镜分辨率为,0.2m,电镜分辨率为,0.2nm,。,分辨率,(resolution),是指将临近两点清晰区分辨认的能力,以,r,表示,:,r=0.61/n,sin,分辨率取决于光的波长,(),和物镜的数值孔径,(numerical aperture,NA),。,=0.53m,，,n,sin,即,NA,(,干透镜最大不超过,1,油镜可达,1.4,),。,二,.,光学显微镜技术：,标本制备,:,材料的固定包埋切片染色,1.,普通光学显微镜,:,最大分辨率为,0.2m,2.,荧光显微镜,:,揭示细胞或细胞间质中的大分子,3.,相差显微镜,:,直接观察活细胞,4.,激光扫描共聚焦显微镜,:,获得细胞结构的三维图象,5.,荧光漂白恢复技术,:,检测活体细胞表面或内部分子运动情况,三,.,电子显微镜技术,：,1.,电子显微镜的种类：,透射电镜、扫描电镜、分析电镜、高压电镜,2.,电镜样品制备技术：,.,超薄切片术,:,样品固定脱水包埋,(,树脂,),超薄切片,(,约,50nm,厚,),捞于铜网上染色,(,重金属盐,),.,冷冻制样技术,:,.,负染色技术,:,.,真空镀膜技术,:,.,冷冻蚀刻技术,:,样品的液氮超低温冷冻断裂蚀刻,(,使断面的冰升华,),复型,(,喷涂铂与碳制作断面复型膜,),剥膜,(,腐蚀掉样品，剩下复型膜,),捞于铜网上电镜观察,.,扫描电镜样品的制备技术,:,样品固定,(,锇酸、戊二醛、高锰酸钾等,),(,临界状态下对样品进行,),干燥金属镀膜电镜观察,四,.,扫描探针显微技术：,1.,扫描探针显微镜,(SPM),：,构成,:,扫描装置,探针,:,不同类型的探针可测定样品表面不同属性,探针位移传感器,:,探测并调整探针与样品间距离,其它,:,计算机等,2.,扫描探针显微镜应用：,DNA,研究,:,双螺旋图象和碱基对水平结构。,蛋白质研究,:,在溶液中,(,可保持蛋白质生理状态,),观测蛋白质结构,生物膜研究,:,观察吸附在固体表面活溶液中的膜、膜表面蛋白或脂,质体结构及分布。,第二节,.,细胞化学技术,一,.,酶细胞化学技术：,以酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的分布及酶活性强弱。可检测水解酶、氧化酶、还原酶、裂解酶、合成酶和异构酶。步骤：,底物,+,酶 产物,+,捕捉剂 终产物（颜色、沉淀或电子密度高的物质）镜检,二,.,荧光细胞化学法：,依据某些物质（荧光色素）经紫外光照射后发荧光的特点，进行特异性显示。,三,.,免疫细胞化学技术：,免疫细胞化学,(immunocytochemistry),利用免疫反应对组织或细胞的抗原分子进行形态定位的一种技术。,基本原理,：,利用抗原与抗体的特异性结合的特点，用标记过的已知抗体检测组织或细胞中相应抗原,。,常用的标记方法有,：,荧光标记,：,酶标记,：,铁蛋白标记,：,胶体金标记：,.,免疫细胞化学方法：,.,包埋法：,.,冷冻超薄切片法：,标本快速冷冻固定冷冻超薄切片蔗糖冻融,PBS,漂洗免疫标记甲基纤维素处理干燥电镜观察,四,.,放射自显影技术：,五,.,细胞显微分光光度测定技术：,细胞内的化学成分在自然状态下或化学反应染色后，均能吸收光谱的某一特定波段,(230-700nm),如,DNA,对紫外光的最高吸收波段是,2,60nm,蛋白质,的吸收波段是,280nm,。,显微分光光度术,(microspectrophotometry),是显微镜技术和分光光度技术的结合，根据细胞内某些物质对光谱吸收的原理，定量测定一个细胞或细胞某一部分结构内化学成分。方法有紫外光显微分光光度法和可见光显微分光光度法,(,需对样品染色,),。,第三节,.,细胞及其组分的分离纯化和分析,一,.,流式细胞技术,(flowcytometry),：,用,流式细胞仪,(flowcytometer,FCM),分选或检测细胞及其组分的物理或化学特性的技术。,1.,流式细胞仪的构成和工作原理：,.,细胞流动室：,.,光源和聚光装置：,.,信号检测器：,.,计算机系统：,2.,样品的制备及应用：,.,细胞样品的制备,:,FCM,适用于单个细胞或细胞组分样品的分析,(,将样品制成单细胞悬液,),。,.,细胞的固定和染色：,.,细胞的分选：,3.,细胞分级分离：,.,差速离心法,(differential centrifugation),.,密度梯度离心法,(density gradient centrifugation,）,.,免疫磁珠,(immunomagnetic microsphere),技术,第四节,.,细胞培养技术,一,.,体外细胞培养技术,:,细胞培养,(,cell culture,),是指从活体中取出小块组织并分离出细胞，在一定条件下进行培养，使之继续生长增殖的方法。细胞培养分,原代培养,(,primary culture cell,),和,传代培养,(,subculture cell,),。,二,.,细胞冻存和复苏技术,:,细胞的保存和运输,三,.,细胞的同步化技术,:,细胞动力学和细胞周期的研究,四,.,细胞融合技术,:,产生新细胞,1.,细胞融合,(,cell fusion,),:,指两个或两个以上细胞合并形成一个细胞的过程。,2.,单克隆抗体技术,:,第五节,.,细胞分子生物学研究方法,一,.,电泳技术,(electrophoresis):,带电物质,(,细胞、蛋白质、核酸等,),在外加电场作用下发生泳动的现象，称为电泳。,二,.,核酸杂交,:,1.,Southern,印迹,:,DNA,杂交技术,2.,Northern,印迹,:,RNA,杂交技术,3.,原位分子杂交,(in situ hybridization),技术：,将标记的核酸探针与细胞、组织或染色体中的核酸进行分子杂交的技术。步骤：,.,样品的固定,；,.,杂交前欲处理,；,.,探针的标记,；,.,杂交,：在一定条件,(,温度、,PH,、杂交液和离子强度,),下进行；,.,杂交结果的检测,。,(c),(b),引物,2,5,3,3,3,5,5,(d),新引物,5,3,靶,DNA,的扩增,(a),5,3,引物,1,3,5,3,5,引物,2,互补链,引物,1,互补链,单位长度的链,不同长度的链,5,3,3,5,引物,1,互补链,引物,2,互补链,目的片段（不同长度的链未示出）,聚合酶链式反应,(PCR),示意图,(e),(f),(g),三,.,聚合酶链反应,(polymerase chain reaction,PCR),技术,:,四,.,反义核酸技术：,能与有功能的核酸链,(,通常指,RNA,),互补结合并干扰其功能的,RNA,或,DNA,，称,反义核酸,。,利用反义核酸影响对应的,mRNA,的转录、翻译,以改变细胞生物学功能的技术称反义技术,(antisense technology),反义技术可应用于：,1.,基因功能研究：观察与反义核酸互补的的基因在细胞增殖、分化、发育、代谢等过程中的作用和功能。,2.,病毒基因组功能研究：,3.,作为药物：医治病毒性疾病；抑制癌基因表达、增殖、浸润、转移；杀灭寄生虫。,五,.,转基因技术,:,用物理的、化学的或生物的方法将外源基因转入受体细胞内，并使之表达的技术。,六,.,DNA,顺序测定,:,七,.,RNAi,技术与基因敲除技术：,基因关闭,基因敲除,(knock out of gene):,genes are inactivated by a directed mutation.,基因敲入,(knock in of gene):,a gene is introduced in a specific locus to replace another gene.,八,.,酵母双杂交系统,:,蛋白质间相互作用的研究,九,.,X-,射线衍射技术,:,生物大分子结构测定,十,.,双向电泳技术,:,蛋白质分离,十一,.,质谱：,蛋白质分析,十二,.,蛋白芯片,:,检测基因表达,
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