DNA重组的基本工具44446

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程,专题1,基因工程的别名,操作环境,操作对象,操作水平,基本过程,DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,剪切,拼接,导入,表达,基因工程是指,按照人们的愿望,，进行严格的设计，并通过,体外,DNA重组和转基因等技术，赋予生物以,新的遗传特性,，从而创造出更符合人们需要的新的,生物类型,和,生物产品,。由于基因工程是在,DNA分子水平,上进行设计和施工的，因此又叫做,DNA重组技术,。,基因工程的概念,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。,让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。,想一想,需要做哪些关键工作？,苏云金芽孢杆菌,毒蛋白,普通棉花抗虫棉,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,“分子手术刀”,限制性核酸内切酶,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,抗虫基因与棉花DNA“缝合”,关键步骤三：,抗虫基因进入棉花细胞,“分子缝合针”,DNA连接酶,“分子运输车”基因进入受体细胞的,载体,1.1、DNA重组技术的基本工具,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,1.,主要来源：,种类与命名：,作用特点：,4.,限制酶识别序列,5.,作用结果：,识别双链DNA分子的某种,特定,核苷酸序列，并且使每条链中,特定部位,的两个核苷酸之间的,磷酸二酯键,断开。,主要从原核生物中分离纯化,产生黏性末端或平末端,Go on,大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成,少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,寻根问底,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵,，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。,限制酶,就是细菌的一种,防御性工具,，当外源DNA侵入时，会利用限制酶,将外源DNA切割,掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、,使之失效,，从而达到,保护自身,的目的。,Go back,种类与命名：,现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。,E,co,R,S,ma,粘质沙雷氏杆菌,（,Serratia,marcesens,）,大肠杆菌,（,Escherichia,coli,R,）,Go back,练习：流感嗜血杆菌的d菌株(Haemophilus influenzae d)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:,Hin,d、,Hin,d和,Hin,d,限制酶,DNA解旋酶,区别,限制性内切酶与DNA解旋酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键,将DNA两条链的氢键打开形成两条单链,限制酶,DNA水解酶,区别,限制性内切酶与DNA水解酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段的DNA.,切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。,Go back,EcoR,黏性末端,黏性末端,Go back,EcoR,黏性末端,黏性末端,重复演示,Go back,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个,伸出的核苷酸,，它们之间正好,互补配对,，这样的切口叫,黏性末端,。,Sma,平末端平末端,1、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,2、如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，产生的末端会是什么关系？,会产生,相同的黏性(平)末端,思考?,3、不同限制酶切割形成的粘性末端能发生黏合吗？借助什么方式来完成黏合？,能，前提是不同限制酶切割形成的黏性末端要互补，通过碱基互补配对形成氢键的方式来完成黏合。,GAATTC,CTTAAG,GAATTC,CTTAAG,EcoR,G,AATTC,CTTAA,G,G,AATTC,CTTAA,G,不同来源的DNA片段混合,将不同种来源的DNA片段连接起来,生物A基因片段,生物B基因片段,GAATTC,CTTAAG,酶切,GAATTC,CTTAAG,GAATTC,CTTAAG,GAATTC,CTTAAG,同一种,DNA,聚合酶,DNA,连接酶,区别1,区别2,相同点,寻根问底,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,1)只能将,单个核苷酸,连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成,磷酸二酯键,1)在,两个DNA片段之间,形成磷酸二酯键,2)以,一条DNA链为模板,，,将,单个核苷酸,通过磷酸二酯键,连接成一条互补的DNA链,2)将DNA双链上的,两个缺口同时连接,起来，,不需要模板,可把黏性末端之间的,缝隙“缝合”,起来，,Ecoli DNA连接酶或T,4,DNA连接酶,即,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,T,4,DNA连接酶,还可把,平末端之间的缝隙“缝合”,起来，但效率较低,T,4,DNA连接酶,二、“分子缝合针”DNA连接酶,作用:,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将,脱氧核糖和磷酸,连接起来.,作用原理：,催化磷酸二酯键形成,类型：,类型,Ecoli,DNA连接酶,T,4,DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T,4,噬菌体,恢复,磷酸,二酯键,只能连接,黏性末端,能连接,黏性末端,和,平末端,(效率较低),相同点,差别,三、“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,载体需要的条件：,有1,多个限制酶切点,对受体细胞无害,导入基因,能在受体细胞中复制、表达,有某些标记基因，便于鉴定和筛选,(5)要大小适宜,常用运载体：,细菌的质粒、酵母菌（真核）的质粒,噬菌体衍生物,或某些动植物病毒,假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？,作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？,霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？,目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？,常用的载体：质粒,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,思考与探究 P7（2）,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者,不具备,这种限制酶的,识别切割序列,；或者通过甲基化酶,将甲基转移,到所,识别序列,的碱基上，使,限制酶不能将其切开,。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？,提示：,基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。,是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？,不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：,思考与探究 P7,1）载体DNA必需有,一个或多个限制酶,的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是,在质粒本身需要的基因片段之外,，这样才不至于因目的基因的插入而失活。,2）载体DNA必需具备,自我复制的能力,，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的,复制而同步复制,。,3）载体DNA必需,带有标记基因,，以便重组后进行重组子的筛选。,4）载体DNA必需,是安全的,，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。,5）载体DNA分子,大小应适合,，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。,实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？,迄今为止，所发现的DNA连接酶都,不具有,连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。,思考与探究 P7,1,.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）,同种限制酶 B.两种限制酶,同种连接酶 D.两种连接酶,A,课堂练习,2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是,A、能复制 （）,B、有多个限制酶切点,C、具有标记基因,D、它是环状DNA,D,课堂练习,3.以下说法正确的是 （）,A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,B、质粒是基因工程中唯一的运载体,C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接,D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,课堂练习,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,达尔文,提出,生物进化论,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,孟德尔,提出基因的,分离定律,和,自由组合定律,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,摩尔根,证明,基因在染色体上,，并提出基因的,连锁互换定律,。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,艾弗里,证明,DNA是遗传物质,，DNA可从一种生物个体,转移,到另一种生物个体。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,沃森,、,克里克,提出DNA的,双螺旋结构,模型。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,梅塞尔松,、,斯塔尔,证明DNA的,半保留复制,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,克里克,等提出,中心法则,DNA,RNA,蛋白质,转录,翻译,逆转录,复制,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,1963年,尼伦伯格,和,马太,破译编码氨基酸的,遗传密码,，1966年,霍拉纳,用实验加以证明。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,1)基因转移载体的发现,2)工具酶的发现,3)DNA合成和测序技术的发明,4)DNA体外重组的实现,5)重组DNA表达实验的成功,6)第一例转基因动物问世,7)PCR技术的发明,演讲完毕，谢谢观看！,