双向电泳操作双向电泳的技术流程和样品制备cqwn

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,双向电泳的技术流程和样品制备,史须,北京大学人类疾病基因研究中心,基因组学与蛋白质组学,基因组学：,蛋白质组学：可视为分子生物学的大规模筛选技术，目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它们的关系与功能。,上述两种学科的研究内容在互补的水平上研究了细胞的分子架构，又都在各自的水平上提供了增强对方效应的信息，因此二者存在有很强的且带有系统性相互关系。,Applications of proteomics,Protein identification/characterization,Protein-protein interaction,Post-translational modifications,Subcellular location,Elucidation of pathway,Target validation and toxicology,Drug discovery,蛋白质组分析的首要要求,将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。,2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。,生物学问题的提出,实验模型的设计,实验组和对照组样品的制备,蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣蛋白点的切取,胰酶对脱色后蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图、微测序分析,质谱结果的生物信息学分析和比对,新蛋白质的发现,其它实验的进一步验证,蛋白信息的初步获得,蛋白质组研究的基本技术路线,蛋白质样品的制备,双向电泳,图像分析,转印至膜上的蛋白,凝胶中的蛋白,溶液中的蛋白,混合肽,蛋白质质量,N端测序,肽序列质谱数据,肽指纹图,数据搜索,新的或已知蛋白,蛋白转录后修饰的鉴定,双向电泳分析中的样品制备,制备原则,：,应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。,防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。,防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。,完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。,尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。,可溶性样品,固体组织样品,细胞,不同样品的基本处理方法,样品的分级处理,通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。,样品的溶解,是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。,溶解的目标：,1、,样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；,2、,溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；,3、,溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。,增加样品溶解性的手段,变性剂：,通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。,表面活性剂：,经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。,还原剂：,在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或,-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。,起载体作用的两性电解质：,即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。,Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。,样品液的准备,标准液：,Reagent,Amount,8M urea,47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O,50mM DTT or,2mM TBP,385mg or 500ul of 200mM TBP stock,4%CHAPS,2g,0.2%carrier ampholytes,See next table,0.0002%bromophenol blue,100ul of 0.1%stock,ddH,2,O,To 50ml,IPG pH Range,Bio-Lyte Ampholyte(stock),range,Bio-Lyte Ampholyte(stock),Conc.(w/v),Sample Solution Volume,Per 5ml,Sample Solution Volume,Per 50ml,3-10,3/10,40%,25,l,250,l,4-7,4/6,40%,12.5,l,125,l,5/7,40%,12.5,l,125,l,3-6,3/5,40%,25,l,250,l,4/6,40%,12.,l,125,l,5-8,5/8,40%,25,l,250,l,7-10,7/9,40%,12.5,l,125,l,8/10,20%,25,l,250,l,Suggested Bio-lyte ampholyte composition for IPG use,Reagent,Amount,7M urea,4.1ml of 8.5 stock or 2.1g urea in 3ml H,2,O,2M Thiourea,760mg,2mM TBP,50ul of 200mM TBP stock,4%CHAPS,200mg,0.2%carrier ampholytes,See table,0.0002%bromophenol blue,10ul of 0.1%stock,ddH,2,O,To 5ml,Multiple chaotropic agent solution preparation,Reagent,Amount,5M urea,2.9ml of 8.5 stock or 1.5g urea in 3ml H,2,O,2M Thiourea,760mg,2mM TBP,50ul of 200mM TBP stock,2%CHAPS,100mg,2%SB3-10,100mg,0.2%carrier ampholytes,See table,40mM Tris,24.2mg,0.0002%bromophenol blue,10ul of 0.1%stock,ddH,2,O,To 5ml,Multiple surfactant solution preparation,样品中核酸的去除,对电泳的影响：,增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。,解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。,亚蛋白质组样品的制备,用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。,顺序抽提法：,根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。,第一步：用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；,第二步：把未溶解的pellet用标准IEF样品液溶解提取高疏水性蛋白；,第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。,特殊样品的制备,低丰度蛋白的分离：,尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。,强碱性蛋白质（如核糖体）的处理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH312、4-12或10-12）进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12）的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12）等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。,极端分子量的蛋白质：,小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的dodelcyl sulfate ions持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。,一维固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG）：,IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH310不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。,IPG,胶条的重泡胀,泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF。,不同的加样方法和加样量会导致最终结果的差异：,Protean IEF cell、IPGphor等集成设备的使用：,20mmol/L DTT 垫片的使用：,温度的选择：,蛋白载样量,影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括：,待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。,电泳的目的：如果只是得到一张好的图片，则无需考虑太多其它因素。,待研究蛋白的丰度：,样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。,IPG胶条的pH范围：,IPG胶条的蛋白质大约载样量,IPG Strip length,Analytical Load,(silver staining),Preparative Load,(Coom staining),7cm,10100,g/125,l,200500ug/125,l,11cm,50200,g/185,l,2501000ug/185,l,17cm,100300,g/300,l,13mg/300,l,IPG IEF 中pH,梯度的选择,常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。,预分步收集,细胞浆,细胞核,细胞膜,核糖体及其他特定细胞成份,细胞分泌成份,pH4-12,pH3-10,pH4-7,pH5-8,pH7-10,pH6-11,pH3-6,pH3-4,pH4-5,pH5-6,pH6-7,pH7-8,pH8-9,pH9-10,pH10-11,pH11-12,第一步,第二步,第三步,用窄pH范围阵列分离低丰度或交叉覆盖蛋白,阵列那些亚细胞定位位置的功能蛋白质,亚蛋白质组阵列策略的框架图,3倍,3倍,聚焦时间的优化,理论上讲，要