蔡锡渠—宫颈癌筛查技术HPV12+2检测课件

,宫颈癌筛查技术,HPV12+2,分型检测,宫颈癌筛查技术,一、,HPV12+2,检测的意义及临床应用,一、HPV12+2检测的意义及临床应用,3,HPV,的型别,目前已发现超过,200,种型别的人乳头瘤病毒（,HPV,）。,依据与生殖道肿瘤相关性，将,HPV,分为：,低危型,常引起外生殖道湿疣等良性病变；,6,、,11,、,42,、,43,、,44,等。,高危型,与子宫颈癌及子宫颈上皮内瘤变（,CIN2/3,）的发生相关；,16,、,18,、,31,、,33,、,35,、,39,、,45,、,51,、,52,、,56,、,58,、,59,、,68,等。,3HPV的型别目前已发现超过200种型别的人乳头瘤病毒（HP,HPV,分型检测的意义,（,1,）预测受检者发病的风险度，确定最佳的治疗时期,Gary M.Clifford et al;Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005;14(5):115764,提示：不同的高危型促进,LSIL,（低度鳞状上皮内病变）向,SCC,（鳞状细胞癌）转变的能力有差异,。,HPV16,，,18,的致宫颈癌风险性大于其他高危型,HPV,。,HPV分型检测的意义（1）预测受检者发病的风险度，确定最佳,基线筛查细胞学阴性/高危HPV阳性的女性10年内CIN3病变的累积发病率,Khan MJ,et al.J Natl Cancer Inst,2005;97:10721079.,Follow-up time(months),Other high-risk HPV+,HPV18+,High-risk HPV,HPV16+,Cumulative incidence rate of,CIN3(%),17.2%(11.522.9)HPV16+,13.6%(3.623.7)HPV18+,3.0%(1.94.2),其它高危型,HPV,阳性,0.8%(0.61.1,),高危型,HPV,阴性,4.5,15,27,39,51,63,75,87,99,119.5,111,0,20,15,10,5,0,基线时,HPV16/18,阳性者相比其它,12,种高危,HPV,型别阳性者，有更高风险进展为高度宫颈病变,HPV16/18,阳性的短期风险也明显高于其它致癌型,HPV,阳性,基线筛查细胞学阴性/高危HPV阳性的女性10年内CIN3病,对,204,例宫颈癌患者前瞻性研究发现，,HPV18,型感染者是预后不良的重要指标，,HPV18,阳性,5,年存活率,54.1%,，而其他高危型感染的存活率为,83.8%,。,HPV18,型阳性者复发率,53.6%,，而,HPV16,型复发率仅为,15.9%,51,例宫颈癌手术患者中，,9,例发生淋巴转移中有,6,例为,HPV18,型,107,例晚期宫颈癌患者放疗治疗组中，,HPV18,型阳性者,5,年存活率为,15.5%,，而,HPV16,型为,73.1%,对于群体而言,HPV16,型感染危害最大,对于个体而言,HPV18,型感染危险度最高,对204例宫颈癌患者前瞻性研究发现，HPV18型感染者是预后,（,2,）,16,、,18,亚型持续感染的危险性大于其他亚型,对巴西,1611,名妇女在,4,个月间隔,2,次检测,HPV,，,HPV16,，,18,持续阳性致,HSIL,风险性大于其他高危型,HPV,持续阳性。,（,Nicolas F.Schlecht,et.al.,JAMA,.2001;286(24):3106-3114.,）,宫颈癌的必要条件,高危型的,HPV,感染,HPV,持续感染,（2）16、18亚型持续感染的危险性大于其他亚型对巴,（,3,）针对不同型别的感染采取不同的处理方案,相同细胞及组织学类型,HPV,阳性与阴性要区别对待,不同,HPV,感染型别要区别对待,例如：建议,HPV16,18,型的患者直接进行阴道镜检查；而对于其他型别的感染，要结合细胞学诊断，一般不需要采取任何治疗方法，但需要按时随访。,44岁女性，2008年10月24日，妇检宫颈光滑，滴虫（+）HPV16，52（+），TCT：炎细胞中度。,未行阴道镜检查,，2010年10月18日。阴道镜下宫颈活检病理:鳞状细胞癌（中分化）。未按规范筛查及随访，导致宫颈癌发生。,广东省妇幼保健院,案,例,分,析,（3）针对不同型别的感染采取不同的处理方案相同细胞及组织学类,二、凯普,HPV12+2,检测试剂盒,二、凯普HPV12+2检测试剂盒,荧光,PCR,原理,在,PCR,反应体系中有上下游引物，在荧光,PCR,体系中也有上下游引物，还加入了一个荧光基团,-,探针,在,PCR,扩增过程中,特异性引物和探针分别与靶序列结合，由于此时荧光基团与猝灭基团离的很近，猝灭基团对荧光基团的发光起到了抑制作用，因此荧光基团不发光。,Taq,酶在引物的引导下复制靶序列；当遇到结合在两条引物之间的探针时，发挥,5,端外切酶功能，将探针水解，水解下来的荧光基团受激发发射荧光，每合成一条,DNA,链发射一次荧光信号。,当靶序列呈指数增长时，发射的荧光信号量相应增长，因此只要标本中含相应型别的,HPV,病毒就会有荧光信号的积累，从而达到检测,HPV DNA,的目的。,荧光,猝灭,荧光PCR原理 在PCR反应体系中有上下游引物，在荧光PCR,HPV系列产品,13种高危型HPV检测试剂盒,（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68）,不分型,14种高危型HPV检测试剂盒,（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）,对HPV16、18分型,HPV系列产品13种高危型HPV检测试剂盒14种高危型HPV,14,种高危型人乳头状瘤病毒联合,16/18,基因分型检测（,12+2,）试剂盒,产品特点,至少需要四通道以上的荧光,PCR,检测仪器，一次检测出,14,种高危,HPV,型别：,HPV-31,，,HPV-33,，,HPV-35,，,HPV-39,，,HPV-45,，,HPV-51,，,HPV-52,，,HPV-56,，,HPV-58,，,HPV-59,HPV-66,和,HPV-68,，同时能对,HPV16,和,HPV18,进行分型检测。,具有,-globin,基因内对照，可以监测所检测样本的可靠性。,在全封闭体系中完成扩增与检测，有效控制污染,操作简便，自动化操作，完成整个过程只需要,2-3,个小时。,检测区域设计在,HPV,基因组,E,区,，避免造成漏诊。,70%-80%,的宫颈癌都是由,HPV16,、,18,型感染引发的,，可见在,HPV,荧光分型的产品中，对,HPV16,、,18,分型的重要性,SFDA,与欧盟的,CE,认证,资质,14种高危型人乳头状瘤病毒联合16/18基因分型检测（12+,DNA提取,取800ul样本离心得沉淀,加入细胞裂解液50ul，煮沸10min,12000离心10min即可上机,若肉眼未见沉淀，可增加取样量，再次离心收集沉淀；,若沉淀杂质较多，可用细胞保存液洗涤1-2次；,血液多样本，用蒸馏水洗涤1-2次；,粘液多样本，取样时尽量去除粘液。,应注意防止爆盖：,金属浴可压重物（冰盒、冰袋等）,水浴应采用螺旋管盖的离心管,确保离心管质量合格,优点,：简单、快捷、方便。,缺点,：HPV DNA纯度较差，含有血红素、蛋白、脂类等PCR抑制剂。,针对男性样本或女性疣体样本,（棉拭子样本）,，先用细胞保存液/生理盐水洗脱，收集沉淀，而后与上述操作一致,DNA提取 取800ul样本离心得沉淀若肉,PCR试剂配制,按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装,PCR试剂配制按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装,仪器检测通道选择,仪器检测通道选择,我们一般把荧光,PCR,的前,15,个循环信号作为荧光本底信号（,baseline,，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。,检查调整基线,荧光阈值的缺省设置是,3,15,个循环的荧光信号的标准偏差的,10,倍（仪器自动设置，,auto,）。但我们通常采用手动设置（,manual,），手动设置的原则是该阈值要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号出现在荧光信号超过阈值后。,检查调整阈值,结果分析,我们一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信,1,定性结果判读,1）阴性对照Ct值均应显示为Undet。,阳性对照,Ct,值,36,。,符合以上两个条件，此反应是为有效。,2,）样品的,Ct,值显示为,Undet,，判断为阴性。,3,）样品的,Ct,值,40,，判断为阳性；,4,）若为,40,Ct,值,45,的样本建议重做，重做结果,Ct,值,40,者为阳性，否则为阴性。,5,）如果出现,Ct,值,15,的强阳性样本，可直接报告为阳性或自动分析，并将其从样品表中剔除，再按上面步骤分析其他样本，或建议进行,1/100,稀释重做。,定性报告单上，定量结果栏及参考范围设置为,N/A,（无效栏）,结果分析,1 定性结果判读定性报告单上，定量结果栏及参考范围设置为N/,1,扩增曲线出现交叉,扩增曲线出现交叉，主要是因为多引物、多探针反应体系中，每种型别的扩增效率不一样所致。同时，样本本身的原因也可能造成荧光曲线的差异。,常见问题及解决方案,2,单个临床样本扩增曲线底部上坡式不断抬高,加入的样本,DNA,含有很多杂质。,重做，加样前，样本,DNA 13000rpm,离心,10,分钟，移液时取上清，移液器枪头浸入液面,2mm,处。,1 扩增曲线出现交叉常见问题及解决方案2 单个临床样本扩增曲,3,个别荧光曲线突然,(,较大,),下降,反应管内留有气泡，由于温度升高后可能会造成气泡破裂，使荧光值突变降低，加入模板,DNA,后混匀离心，把反应管放置仪器内时要检查管内是否有气泡。,4,阴性对照产生较高荧光,反应,MIX,被污染；反应管不干净，有杂物；反应过程中探针降解。,5,标准曲线的线性关系不佳,加样存在误差，使得标准品不呈梯度；,标准品出现降解，应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。,常见问题及解决方案,3 个别荧光曲线突然(较大)下降常见问题及解决方案,6,阈值设置不同，是否会导致阴阳性结果判断的不统一？,结果的判读不能只依赖于,Ct,值的大小，还要看是否出现明显的扩增曲线。二者结合才能判断试验结果。,阈值设置的高低会使,Ct,值有一定的变化，但变化一般都比较小。只有很少的样本会出现在,Ct=40,左右波动。这样的样本如扩增曲线明显可以判读为阳性，如扩增曲线不明显或荧光增长值不高则建议重做。,常见问题及解决方案,6 阈值设置不同，是否会导致阴阳性结果判断的不统一？常见问题,7,检测方法中“定性”和“定量”的问题,目前，尚没有任何一种检测方法可以达到“定量”检测,HPV,病毒的目的。这是由于采样方法本身的局限性所造成的：,在采集宫颈脱落细胞的过程中，虽然反复强调要采集“,HPV,易感区,转化带”的脱落细胞，但由于不同操作人员对“易感区”部位的判断以及取样手法的不同，我们不能准确评估出取得的细胞样品中携带病毒分子的细胞数量。,比如：在第一次采集细胞样品时，取得了,500,个携带病毒分子的细胞，经过检测后，我们得出患者携带病毒数量是,500,；而对同一位患者进行第二次采集细胞时，由于多刷了一圈或者恰恰取到了“病灶区”，所以取得了,1000,个携带病毒分子的细胞，经过检测，又得出携带病毒数量是,1000,。因为采样操作本身的问题，使得前后这两个数字已经失去了它所具有的含义，因此，再将这两个数字放在一起比较也就不具有任何实际意义。而且，因为病毒载量与病变程度之间的关系尚没有完全阐明，所以,HPV,病毒的定量检测对临床治疗没有任何指导意义。,如果一定要使用“定量”这个词语，那也只能在前面再加上“相对”二字。因为，这个“定量”仅仅是将采集到的细胞样品中的病毒数量进行了“定量”，而不是对