细胞形态结构观察

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第三章 细胞形态结构观察技术,一、活体细胞的观察和摄影技术,1.,倒置显微镜,：,P60,图,3-3,（提问光镜使用注意）,适用,：观察贴壁生长的培养中细胞,构造特点,：因物镜置于观察标本下方而得名,技巧,：调弱光亮度，集光器稍远些，,增大光线反差，对正光轴；,摄影时，使观察物稍偏远离焦点，照片,会更清晰。,底片选用正片，反差大,2.,相差显微镜,P62,图,3-4,适用,：可增强活细胞同背底反差，帮助看清,细胞的轮廓和细胞内细微结构，如：,核仁、染色质、线粒体等。,构造特点,：有两个附加构件：,相差接物镜：其光学系统中有一个光环透镜,相差聚光器：内有数个相位板，使用时与物,镜倍数一致,技巧,：细胞培养瓶质地均匀透明较好，最好用塑,料瓶；观察摄影时，瓶壁要擦净；光轴对,正，照明度适宜，摸索试调至最佳,3.,荧光显微镜,P67,图,3-6,适用,：观察细胞内天然的荧光物质，如维生,素、脂褐素、核黄素等，也可观察可与,荧光染料结合的细胞组分。,构造特点,：与普通光镜比，区别在于用高压汞灯光源，波长可激发荧光物质产生荧光；滤光片不同。,技巧,：观察必须是自发荧光或经荧光染色的标本；选用效果最好的滤光片；荧光标本易褪色，不能长期保存，观察操作要迅速，作好记录；仪器的高压汞灯光源启动后,15,分钟内不得关闭，关闭后，灯冷却后方可再起动，否则寿命大减，长时间观察标本时，需带护目镜。,4.,暗视野显微镜,P64,图,3-5,适用,：观察记录活细胞或细胞器的运动轨迹，,提高分辨率,构造特点,：只有聚光器不同于普通显微镜，设,有一个中央遮光板使照明光线不能直射。标本进入目镜，只许标本散射光进入目 镜,技巧,：物镜的数值孔径必小于聚光器的数值孔,径；盖玻片，载玻片应清洁无痕；聚光,镜和载玻片之间加香柏油，保证效果。,二,.,显微摄影技术,p68,1.,概念：显微摄影术是利用显微摄影装置拍摄,显微镜视野的物象的技术。,2.,技术类型：胶片相机摄像,数码相机摄像,CCD,图像采集,三者前期操作一致，但成像和图像存储,原理不同。,3.,图像记录原理：,胶片相机摄像,：显微摄影时，光线自标本,片的微小物件射入物镜后，造成一个倒立的放大实像，经目镜进一步放大后，投射在照相底片上，使底片感光而记录下显微镜视野下物象。,数码相机摄像：,是以数字的形式用电子设备储存图像。拍照后，可通过数据线将所拍摄图像传输到电脑，也可将相机的存储卡取出，通过读卡器将拍摄的图像传输到电脑上。,数码相机摄像原理与,CCD,图像采集器相同。,CCD,图像传感器：即,CCD(charge,copled,Device,感光耦合组件）,CCD,的组成结构有三个层次：,上层：聚光镜片（增光镜片）,中层：一个类似马赛克的网络（分色网络）,下层：垫在下层的电子线路矩阵（感应线路,是可记录光线变化的半导体）,CCD,工作方式之一：,当数码相机的快门开启，来自影像的光线穿过，这些马赛克会让感光点的,=,氧化硅材料释放出电子（正电）与电洞（负电）。经由外部加入电压，这些电子和电洞会被转移到不同极性的另一个硅区暂存。电子数的多寡和曝光点所接受的光量成正比。在一个影像最明亮部位，可有十万电子被积存起来。,CCD IMAGE SENSOR,外形,彩色,CCD,的组成结构分图,CCD,的三层结构：上：增光镜片、中：色块网格 下：感应线路,由微型镜头、马赛克分色网格，及垫于最底层的电子线路矩阵所组成,4.,拍摄技术步骤：,胶片相机拍摄：,p69-74(,生物教研室李相伟）,数码相机拍摄：,p74-75(,同上）,CCD,图像采集：（病理教研室姚海涛,（实验中心刘君星）,5.,缩时显微摄影术,适用,：记录细胞或细胞器连续动态变化过程,正常时态连续拍照,缩时逐格拍照,主要装备,：倒置显微镜，,16mm,摄影机，自控,缩时启动拍摄装置。,原理：,缩时间隔时间：,目标物实际活动时间,X 1/24,影片排成后要求放镜时间,=3600,秒,10,秒,x 1,24=15,秒,所以，每隔,15,秒摄取,1,张照片。,三、光镜下的固定细胞观察法（组胚，病理）,细胞器培养皿内铺盖片单层培养 取盖片,细胞悬液 离心沉淀 涂片 固定,染色 观察 拍照,（固定剂，染色剂知识介绍）,固定剂的作用：穿透，固定，保形，防腐,固定剂的选择：,P83,细胞内组分的差异染色。,染色剂的选择：,Giemsa,染色体桃红色。本书,P84,Feulgen,DNA,紫红色，细胞质绿色。鄂,P141,吖啶橙,RNA,红色，,DNA,亮绿色。本书,P86,苏木精,-,伊红（,HE),细胞核蓝色，细胞质红色,本书,P85,过碘酸席夫,细胞内含糖原区,紫红色。章,P58,苏丹红,III,细胞内含脂肪区,橘红色。章,P59,鬼笔环肽,溦丝染色。章,P59,免疫荧光法,溦管染色。章,P60,联苯胺,+H2O2,过氧化氢体染色。小章,P37,詹纳斯绿,B,活体细胞线粒体。小章,P43,四、激光扫描共聚焦显微镜技术（实验中心）,1,.,概念和原理,P76,laster,scanning,confocal,microscope LSCM,激光共聚焦显微镜是,20,世纪,80,年代以来发展起来的,一项细胞生物学和高分子材料科学领域的高科技分,析仪器。,其在传统光学显微镜基础上，利用激光作,为光源，经照明针孔可形成点光源照射荧光样品，,所产生的激发光斑被探测器针孔以共轭的形式接收,于同一焦平面上，可通过计算机控制显微镜移动，,以实现在同一焦平面（,x-y,),上的逐点扫描。计算机以像点的方式在计算机屏幕上形成图像。同时，也可沿,z,轴方向逐渐改变焦平面，完,成对样品厚片不同层面的扫描，进行类似,CT,断,层扫描的无损伤连续光学切片，经计算机三维重,建处理，可形成观察标本的三维结构图形。,2.LSCM,的主要组成部分及工作原理,激光光源,:,氢离子激光,能同时,/,顺序,/,分别输出紫外光和可见光,照明针孔,:,使激光通过照明针孔后形成点光源,点光源具有方向性强,发散小、亮度高等优点,光束分离器：可将样品经点光源照射所激发的荧光与其它非信号光线分开，排除非信号光线干扰，提高分辨率和清晰度。,物镜,焦平面：激光点光源照射标本样品，激发样品发射荧光，形成焦点光斑，在焦平面处聚焦成像。,探测器针孔：起到空间滤波器作用。阻断非聚焦平面散色光和焦平面上非焦点光斑散色光。保证样品所衍射的聚焦光斑和探测器针孔的成像光斑，包含相同信息。（两点共扼聚焦）,光电倍增器：接受通过探测器针孔的光信号，转换成电信号后转输至计算机，在屏幕上形成焦平面图形,多荧光通道,:,可以同时对样品进行多种荧光标记的信号检测,计算机控制系统：控制步动电动机带动显微镜移动，实现在同一焦面,(,x-y,轴,),上逐点扫描；控制共聚焦系统；控制沿,z,轴改变焦平面，进行对样品厚度的连续光学切片和对样品结构的三维重建；控制信号的采集、转输、分析。,3.LSCM,相对光学显微镜的优点,LSCM,的图像是以电信号形式记录下来的，可用电子计算机技术模拟数字化处理,利用共聚焦系统有效排除了焦点外信号干扰，不仅提高了,x-y,轴焦平面分辨率和清晰度，而且可对观察样品进行,z,轴无损伤光切片，实现三维结构的定位成像,可广泛应用于活细胞的形态、结构，定量、定性、定位分析。与荧光探针技术结合，可进行单细胞分选和多种细胞分子生物学研究及细胞机能学研究,4.LSCM,的应用,贴壁细胞的分选,数量较多细胞群的分选,:,在特别培养皿上一类细胞群经荧光染色，另一类细胞群未经染色，可用高能激光把荧光染色的细胞群杀死，而另一类保存，可继续培养。,少量或单克隆细胞的分选：对于选中的突变细胞、杂交细胞或肿瘤转移细胞，可利用铺有特制膜的培养皿上，在选中的细胞克隆周围切割成八角带，再用高能激光杀伤八角带之外的细胞。,细胞形态学研究：可行,X-Y,焦平面形态研究，尤其是可行工,z,轴三维形态结构研究。可对细胞形状，周长，面积，平均荧光强度，也可对细胞内溶酶体，线粒体，内质网，细胞骨架，结构性蛋白形态、数量、位置的描述。,细胞内某些大分子组分分析：与免疫荧光技术和荧光探针技术相结合，可对细胞内蛋白、,DNA,、,RNA,、酶、受体等组份进行定性定量定时定位分析，以及细胞内,PH,和细胞内某些离子进行分析。用于细胞机能学研究。细胞通讯研究。,细胞机能学研究及细胞通讯研究,细胞显微外科手术：在,LSCM,镜下可将激光作光子刀使用进行细胞穿孔、染色体精切，细胞器烧灼，神经元突触切除，细胞器转移等手术。,五、电镜观察法,P78,分辨率,：肉眼,0.1mm,光镜（油镜）,0.2um,电镜可达,0.08nm,培养细胞的电镜观察途径,透射电镜观察 内部结构 原位切片,组织消化分离后切,扫描电镜观察,c,表面结构 原位扫描观察,消化分离观察,锇酸固定剂的发现,：锇酸用量很少，但代价昂贵，事先同电镜室商量。,（研究生课程专设有电镜课）,用途,：,观察细胞的亚微结构，进行生理、药理、病理学研究。,如：核糖体分布与脱粒,线粒体变形,溶酶体异常,细胞膜表面结构和吞饮作用，微绒毛变异,细胞骨架紊乱,精子结构异常,（见,P82,电镜照片）,