分子生物学常用技术及其应用课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子生物学,常用技术及其应用,分子生物学 常用技术及其应用,主要内容,基 因 工 程,重组DNA技术-基因工程,核酸分子杂交技术,PCR 技术,基因诊断与基因治疗,主要内容基 因 工 程,第一节基 因 工 程,第一节基 因 工 程,基因工程的基本概念,工具酶,载体,重组DNA技术的基本原理,重组DNA技术的基本过程,基因工程在医学中的应用,基因工程的基本概念,一、基因工程的基本概念,DNA重组：不同来源的DNA分子可以通过末端共价连接而形成重新组合的DNA分子的过程。,基因工程：将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白或多肽产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作。,一、基因工程的基本概念DNA重组：不同来源的DNA分子可以,二、工具酶,限制性核酸内切酶,其它工具酶,1、DNA连接酶,2、DNA聚合酶,3、逆转录酶,4、多核苷酸激酶,5、碱性磷酸酶,6、末端脱氧核苷酸转移酶,二、工具酶限制性核酸内切酶,三、载体,质粒,噬菌体,粘粒,病毒,三、载体质粒,四、重组DNA技术的基本原理,四、重组DNA技术的基本原理,五、重组DNA技术的基本过程,目的基因的制备方法：,1、基因组DNA文库,2、制备cDNA文库,3、PCR,4、化学合成,五、重组DNA技术的基本过程目的基因的制备方法：,目的基因与载体的连接方法：,1、粘性末端连接,2、同聚物加尾连接,3、平末端连接,4、人工接头连接,目的基因与载体的连接方法：,将外源DNA导入宿主细胞方法：,1、转化,2、感染,将外源DNA导入宿主细胞方法：,目的基因的筛选和鉴定方法：,1、遗传学方法,2、分子杂交法,3、免疫学方法,目的基因的筛选和鉴定方法：,克隆基因的表达,克隆基因的表达,六、基因工程在医学中的应用,医学基础的研究,疾病的诊断和基因治疗,基因工程药物,转基因动物,人类基因组计划,蛋白质工程,六、基因工程在医学中的应用医学基础的研究,第二节,重组DNA技术-基因工程,第二节,重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。,重组DNA技术（,Recombinant DNA Technique,）,是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。,这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。,重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是,一、限制酶,限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。,发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。,一、限制酶 限制性内切核酸酶(restrictiv,1、限制酶的命名,根据其来源命名。如：,属名 菌株名,E,co,R I,种名 编号,EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。,1、限制酶的命名 根据其来源命名。如：,2、限制酶识别序列和切割形成,每种限制酶能识别和切割的通常48个核苷酸序列，称为限制性位点或切点。,如：Hare 5-GGCC-3,Bam HI 5-GGATCC-3,平末端(blunt end) 对称轴切，连接效果差,切割形成 粘性末端（sticky end）交错切。,2、限制酶识别序列和切割形成 每种限制酶能识别和切割的,分子生物学常用技术及其应用课件,部分常用限制酶及切点,部分常用限制酶及切点,互补末端连接,互补末端连接,产生相同序列的突出末端的不同片段可有三种方式：,1)用同一种限制酶切割；,2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割；,3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割。,产生相同序列的突出末端的不同片段可有三种方式：1)用同一,3、特点：,根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途：,1) 不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。,2) 用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。,3)Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。,3、特点： 根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重,二、基因运载体及其选择,载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。,二、基因运载体及其选择 载体（Vector）:将外源目的DN,载体具以下特征,：,1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖；,2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点；,3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。,常用的载体有,：质粒，噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等。,载体具以下特征：,（一）.质粒plasmid,Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。,PBR322,大肠杆菌,pSC101,Plasmid chromosome,COIEI,plasmid,革兰氏阴性菌,pc194,scp12,真核生物-酵母质粒,（一）.质粒plasmid Plasmid 独立于细菌染色,常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色。从而筛选阳性菌落。,EcoRI,HindIII,Ori复制起点,LacZ,AP,R,pUC19,常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长度,（二）.-噬菌体(phage),是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌.-噬菌体DNA是线状双链DNA分子,全长约50kb,每条链各带12bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。,改建后的噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如：,（二）.-噬菌体(phage)是一种可在体外包装的细菌,1、置换载体 溶解途径,载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA。,2、插入载体 裂解途径,DNA在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆5kb的cDNA。,1、置换载体 溶解途径,裂解途径,裂解途径,（,三）.粘粒(cosmid vector)（3040kb）,是将质粒和噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasmid 而得名Cosmid。改建后的粘粒含有噬菌体的复制起点和cos 末端。全长8kb。大片段外源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。可包装3045kb长的DNA片段，多用于基因文库构建。,（三）.粘粒(cosmid vector)（3040kb,(四) 大片段DNA克隆载体,人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如：DMD gene 2300kb） ，克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：BAC，PI，YAC等。,(四) 大片段DNA克隆载体 人类和哺乳动物的基因组很大，甚,1、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）,优点：能携带大片段DNA，约300kb。,在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产DNA。,缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，E coli中的F因子。此质粒含有2种基因（part A, part B）。每个E coli能接受 300kbDNA片段。,1、细菌人工染色体（bacterial artificial,2、噬菌体PI载体和PAC,PI噬菌体与噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（110115kb）线性DNA，并在体外包装于PI壳内。PI进入宿主细胞后环化，扩增。,1994年，有人将PI和F因子克隆结合产生PI人工染色体克隆系统-PAC。,2、噬菌体PI载体和PAC PI噬菌体与噬菌体一样，外有蛋,3、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC）,适用于克隆大片段DNA，0.22Mb,3、酵母人工染色体（yeast artificial chr,YAC 的主要功能成份有三：,1,）,着丝粒,：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。,2）,端粒：,保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。,3）,自主复制序列（ARS）元件,：是染色体自主复制的复制起点。,构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。,YAC 的主要功能成份有三： 1）着丝粒：mitosis姊妹,三、DNA重组与分子克隆化,为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载体DNA重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同的DNA片段，,称为DNA克隆，亦称分子克隆。,三、DNA重组与分子克隆化 为获得所需的基因或特异序列，需,基本原理与过程：,1、分离纯化目的基因,2、目的基因 + vector =重组DNA分子,3、重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。,4、筛选含有重组DNA的细胞细胞克隆（cell clone），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。,5、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。,基本原理与过程： 1、分离纯化目的基因,分离纯化目的基因目的基因 + vector =重组DNA分子,分离纯化目的基因目的基因 + vector =重组DNA分,重组DNA,和,分子,克隆,重组DNA,重组DNA和分子克隆的几种方法：,（,依目的基因的来源,）,1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆,2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行,克隆,3、化学合成目的基因进行克隆,4、PCR体外扩增目的片段进行克隆,重组DNA和分子克隆的几种方法：（依目的基因的来源） 1,从基因组中分离目的基因在细胞中克隆,从基因组中分离目的基因在细胞中克隆,筛选含有重组DNA的细胞细胞克隆（cell clone）,筛选含有重组DNA的细胞细胞克隆（cell clone）,筛查含有目的基因的细胞克隆,筛查含有目的基因的细胞克隆,四、目的基因表达,上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。,重组DNA技术的另一目的是获得基因重组后的产物RNA，蛋白质。,就是将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆。（expression cloning）.,四、目的基因表达 上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，,目的基因表达,目的基因表达,（一）,真核细胞的基因在原核细胞（细菌）中表达,原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，RNA剪接因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆,菌为宿主。,真核多肽的表达要求：,1）适当的cDNA（完整的编码序列）；,2）适当的表达载体，提供特定多肽信息；,3）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。,产物特征：,1）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定；,2）活性受限或无活性。,（一）真核细胞的基因在原核细胞（细菌）中表达,(二) 真核细胞基因在真核细胞中表达,真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的环境。常采用酵母或昆虫细胞作为宿主。,应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究特定基因的表达。,产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋白的稳定和功能活性。,(二) 真核细胞基因在真核细胞中表达 真核宿主细胞提供一个相,五,、基因文库,基因文库（gene library）,应用DNA重组技术构建的含有基因组的全部基因的DNA克隆。,五 、基因文库,（,一） 构建基因组DNA文库,（一） 构建基因组,（,二）染色体特异的基因文库 （ chromosome specific library）,单个染色体 细胞克隆,（流式C仪）,细胞 染色体,染色体文库,染色体区带 区带特异,（显微切割 ）,DNA文库,（二）染色体特异的基因文库 （ chromos,（三）cDNA文库（cDNA library）,cDNA文库构建：,特定组织细胞一定发育阶段 总 mRNA,（三）cDNA文库（cDNA library） cDNA,核酸分子杂交技术,第三节,核酸分子杂交技术 第三节,一、分子杂交的原理,DNA双链分子加热变性解链后，如控制好条件，缓慢降温，两条链之间可以根据碱基互补的方式再重新形成双链。（,复性,）,如把不同的DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，就可在不同的分子间形成杂化双链，这就叫,核酸分子杂交,。,一、分子杂交的原理,用途,研究DNA分子中某一种基因的位置，两种核酸分子间的相似性即同源性;,也可用于检测某些专一序列在待检样品中的存在与否等。,用途研究DNA分子中某一种基因的位置，两种核酸分子间的相似性,二、分子杂交的基本方法,Southern印迹杂交,Northern印迹杂交,斑点及狭缝印迹杂交,原位杂交,二、分子杂交的基本方法Southern印迹杂交,三、探针技术,1、探针（probe)：一小段已知序列的用同位素、生物素或荧光染料标记它的末端或全链的多聚核苷酸链。,2、探针技术：将探针与固定在NC膜 上的DNA或RNA进行结合反应，探针的序列如果与NC膜上的核酸序列相互补，就可以结合到膜上的相应区带，经放射自显影或其他检测手段就可以叛断膜 上是否有同源的核酸分子存在。,三、探针技术1、探针（probe)：一小段已知序列的用同位素,第四节,PCR 技术,第四节,何谓PCR？,是体外有引物介导的特定DNA序列的酶扩增反应。,何谓PCR？,一、PCR的基本原理,根据碱基配对原理利用DNA聚合酶和dNTP的参与下，引物依赖于DNA模板特性引导了DNA合成。,一、PCR的基本原理根据碱基配对原理利用DNA聚合酶和dNT,二、PCR的基本反应,以DNA为模板的反应,以mRNA为模板的反应,PCR产物的积累规律,二、PCR的基本反应以DNA为模板的反应,三、PCR的主要用途,（一）目的基因的克隆,1 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知的目的基因片段；,2 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段；,3 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机克隆基因。,三、PCR的主要用途（一）目的基因的克隆,（二）基因的体外突变,（三）DNA的微量分析,（二）基因的体外突变,第五节,DNA芯片技术,第五节,DNA芯片技术的概念和主要类型,DNA芯片技术的基本原理和方法,DNA芯片技术的应用,DNA芯片技术的概念和主要类型,第五节,基因诊断与基因治疗,第五节,一、 基因诊断,（一）基因诊断的常用技术方法,1、核酸分子杂交,2、聚合酶链反应(PCR),3、单链构象多态性检测,4、限制性内切酶酶谱分析,5、DNA序列测定,6、DNA芯片技术,一、 基因诊断（一）基因诊断的常用技术方法,（二）、基因诊断的应用,1、遗传性疾病,2、遗传易感性疾病,3、感染性疾病,4、肿瘤,5、法医鉴定和组织配型,（二）、基因诊断的应用 1、遗传性疾病,二、 基因治疗,基因治疗的概念,基因治疗的基本程序,基因治疗研究的主要内容或策略,基因治疗的应用与展望,二、 基因治疗 基因治疗的概念,