核酸及理化性质

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,核酸及理化性质,一、核酸的种类与分布,一核酸的种类 RNA、DNA,核糖核酸ribonucleic acid-RNA:,转移RNA(transfer RNA-tRNA) 、信使RNA(messenger RNA-mRNA)、核糖体RNAribosomal RNA-rRNA,小分子细胞核RNAsnRNA、染色质RNAchRNA、反义RNAantisense RNA、双链RNAdsRNA、细胞质小RNAscRNA、具有催化活性的RNAribozyme、各种病毒RNA。,功能 ：三者共同参与遗传信息的表达。,2,脱氧核糖核酸deoxyribonucleic acid- DNA，是遗传信息的载体，负责遗传信息的贮存和发布。,3,真核生物,原核生物,DNA,细胞核（95%）,线粒体、叶绿体（5%）,核质区（拟核）,RNA,细胞质（75%）,线粒体、叶绿体（15%）,细胞核（10%）,细胞质,二核酸的分布,4,二、核酸的生物学功能,1928年，英国科学家Griffith,发现肺炎链球菌使小鼠死亡的,原因是引起肺炎。细菌的毒性是,由细胞外表中的多糖所决定的。,5,1944年，O.T.Avery美,肺炎链球菌的转化实验,首次,证明DNA是细菌遗传性状的转化,因子。,十年后证明,DNA,是遗传物质,S,R,S+R,S,菌体的,DNA + R,S,6,1952年，美国冷泉港,Hershey-Chase,噬菌体浸染细菌的实验。,7,DNA的根本功能是作为遗传信息的载体，为生物遗传信息复制以及基因信息的转录提供模板。,DNA分子中具有特定生物学功能的片段称为基因gene。一个生物体的全部DNA序列称为基因组genome。基因组的大小与生物的复杂性有关，如病毒SV40的基因组大小为5.1103bp，大肠杆菌为5.7106bp，人为3109bp。,一DNA生物学功能,8,二RNA生物学功能,RNA的功能：,rRNA(75-80%),tRNA(10-15%),mRNA(2-5%),2.遗传物质病毒,9,第二节：核酸的化学组成,一、核酸的元素组成,根本元素：C H O N P,核酸的元素组成有两个特点：,1. 一般不含S。,2. P含量较多，并且恒定9%-10%。,因此，实验室中用定磷法进展核酸的定量分析。DNA9.9% 、RNA9.5%,10,二 核酸的分子组成,核酸DNA和RNA是一种线性多聚核苷酸，它的根本构造单元是核苷酸。,核苷酸本身由核苷和磷酸组成。,而核苷那么由戊糖和碱基形成,所以， 核酸,核苷酸,磷 酸,核苷,戊糖 碱基,11,Nucleotides Linked by Phosphodiester Bond,OH,PO,4,2-,Phosphodiester bond,O-P=O,-,O,O,5,3,PO,4,2-,OH,3,5,P,R,P,R,P,R,P,R,P,R,P,R,1,2,3,5,1,2,3,4,5,6,A kind of phospho-polysaccharides,Juang RH (2004) BCbasics,12,The Notation for Nucleic Acids,P,R,B,3,2,5,1,A,T,C,G,A,T,C,G,P,OH,5,3,5,p,A,p,T,p,C,p,G,p,A,p,T,p,C,p,G,-,OH,3,5,p,ATCGATCG,-,OH,3,ATCGATCG,13,The Two Chains of DNA Are Antiparallel,5,p,C,p,G,p,A,p,T,p,C,p,G,p,A,p,T,-OH,3,5,p,A,p,T,p,C,p,G,p,A,p,T,p,C,p,G,-OH,3,5,3,3,5,14,1参与DNA、RNA的合成、蛋白质的合成、糖与磷脂的合成。,2在能量转化中起重要作用，ATP是生物体内能量的通用货币。,3是构成多种辅酶的成分：NAD、NADP、FAD、FMN和CoA。,4参与细胞中的代谢与调节cAMP、cGMP。,3核苷酸的生物学作用,15,一、核酸的一般物理性质,DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体，都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。用乙醇、氯仿从溶液中沉淀核酸,DNA和RNA在细胞中常以核蛋白形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。,DNA核蛋白 RNA核蛋白,mol/LNaCl - +,1-2mol/LNaCl + -,第三节 核酸的重要理化性质,16,DNA,溶液的粘度很大，而,RNA,溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。,核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中,沉降,下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。,17,二、,核酸的两性性质及等电点,与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团磷酸基也含有弱碱性基团碱基，因而核酸也具有两性性质。,18,由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱基呈现弱碱性，所以核酸的等电点比较低。当核酸分子内的酸性解离和碱性解离相等，本身所带的正电荷与负电荷相等时，此时核酸溶液的pH值即为核酸的等电点pI,DNA的等电点为44.5，RNA的等电点为22.5。核酸在其等电点时溶解度最小。,RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有这种作用。,19,三、核酸的水解,核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断降解。,酸对核酸的作用因酸的浓度、温度和作用时间不同而不同。嘌呤碱基比嘧啶碱基易被水解下来。,20,DNA和RNA对碱的耐受程度有很大差异。,在0.3-1 mol/L NaOH溶液中，在室温至370C条件下RNA几乎可以完全水解，生成2-或3-磷酸核苷；DNA在同样条件下那么不受影响，假设加温至1000C，4个小时也可得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。这种水解性能上的差异，与RNA核糖基上2-OH的羟基参与作用有很大的关系。,在RNA水解时，2-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。,21,2、核酸的酶解,生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。,以DNA为底物的DNA水解酶DNases,以RNA为底物的RNA水解酶RNases,22,根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。,核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端3-端或5-端开场，逐个水解切除核苷酸；,核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开场，在某个位点切断磷酸二酯键。小球菌核酸酶即可外切又可内切,在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。,23,四、核酸的紫外吸收,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260,nm,左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据。,24,五核酸的变性、复性与杂交,核酸的变性是指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链构造的过程。变性核酸将失去其局部或全部的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级构造(碱基顺序)保持不变。,能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。,25,1、DNA,的变性,在理化因素作用下，,DNA,双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致,DNA,的理化性质及生物学性质发生改变，这种现象称为,DNA,的变性,。,引起,DNA,变性的因素主要有：,高温，,强酸强碱，,有机溶剂等。,26, 实质 破坏DNA的空间构造,DNA,的变性,27,DNA,变性后的性质改变：,增色效应,：指,DNA,变性后对,260nm,紫外光的光吸收度增加的现象；,旋光性下降；,粘度降低；,浮力密度增大；,分子量不变；,生物学功能丧失或改变。,28,变性,RNA,本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有,DNA,那样明显。,利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。,因为天然状态的,DNA,在完全变性后，紫外吸收(260,nm),值增加2540%.而,RNA,变性后，约增加1.1%。,29,3.DNA的热变性和解链温度Tm,用加热的方法使DNA变性叫做热变性。,DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将DNA的变性到达50%时，即增色效应到达一半时的温度称为DNA的解链温度melting temperature,Tm,Tm也称熔解温度或DNA的熔点。,一般DNA的Tm值在70-85C之间,30,DNA的变性温度：加热DNA溶液，使其对260nm紫外光的吸收度突然增加，到达其最大值一半时的温度，就是DNA的变性温度融解温度，Tm。,31,Tm的上下与DNA分子中G+C的含量有关，G+C的含量越高，那么Tm越高。,DNA,两股之间的吸引力不同：,CG,之间有,3,个氢键，而,AT,之间,2,个。,32,G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G、 C含量，可通过经历公式计算：,33,DNA,变性,34,4、核酸的复性,变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋构造，这一过程称为复性。DNA复性后，一系列物理、化学性质将得到恢复。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。,35,将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性，这一过程也叫退火annealing)。分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和构造有关。,复性反响的速度用Cot1/2表示。Co为变性DNA复性时的浓度，t为时间，以秒表示。,36,DNA,的复性,定义 恢复到天然双螺旋构造的现象,复性的条件 .足够高的盐浓度,.适当的温度,.恰当的复性时间,37,DNA,复性,38,5、核酸的杂交hybridization,杂交的根底是DNA的复性。,热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋构造，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋构造。,这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。,核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。,39,两条来源不同的单链核酸DNA或RNA，只要它们有大致一样的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，这一现象称为核酸的分子杂交。,核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA杂交。,不同来源的，具有大致一样互补碱基顺序的核酸片段称为同源顺序。,40,核酸的分子杂交,41,核酸的杂交,42,Hybridization of Nucleic Acids,RNA,DNA1,DNA2,Probe,Southern,hybridization,Northern,hybridization,Probe:,Small DNA segment,43,利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的,DNA,或,RNA,片段。,常用的核酸分子杂交技术有：,原位杂交,斑点杂交,Southern,杂交,Northern,杂交,Western,杂交,44,核酸杂交的应用,Southern blotting(Southern,印迹),Northern blotting(Northern,印迹),Western blotting(Western,印迹),45,在核酸杂交分析过程中，常将顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进展标记。这种带有一定标记的顺序的核酸片段称为探针。,6. 探针技术,46,将序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料进展标记，然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。,探针技术属于Southern 杂交的技术范畴。,47,Hybridization of Nucleic Acids,RNA,DNA1,DNA2,Probe,Southern,hybridization,Northern,hybridization,Juang RH (2004) BCbasics,48,Preparation of Traditional Nucleic Acid Probe,Amino acid sequence,GLY-ASP-GLU-SER-SER-VAL-LEU-,GGG-GAC-GAG-TCC-TCC-GTT-CTC-,Nucleic acid sequence,*,Codon degeneracy,*,*,*,*,*,*,*,Synthesizing,oligonucleotide,PROBE:,GGGGACGAGTCCTCCGTTCT,The nucleic acid sequence is,Deduced from amino acid sequence,Chemical synthesis,49,Target gene,DNA,denaturation,Single colony,Lysed,Hybridization,Probe is labeled with radioactive,32,P,50,Colony Is Screened by Hybridization with Probe,Cover with,filter paper,Autoradiography,Add probe,Transferring ,Collect filter,paper,Dissolve cell DNA denatured,Colony hybridization,51,7、核酸芯片Biochip,核酸芯片的根本原理，就是利用类似 Southern blotting 的核酸杂合反响Based on hybridization 。,比起一般的核酸杂交，有几点不同：,(1) 以极细微的色点替代电泳色带；,(2) 一次可以处理上千万个核酸色点，因此对同一 样本可有上千万个测试；,(3) 样本所需的量极小；,(4) 侦测方式简便快速，也配合计算机比对分析。,52,Sample DNA,Each spot contains known DNA,Biochip,Schena (2000) Microarray Biochip Technology, p. A31,Complementary DNA hybridize,Signal appears,Biochip Based on Hybridization,53,每一个点上的 DNA 是什么，才是最重要的决定因素；假设这些 DNA 能够明确指示某种关键性疾病的有无，那么这块芯片便是无价之宝。,这些重要的 DNA 要从哪里来？ 当然还是要经由无数的根底研究。,芯片制作过程是一种技术 (technology)，而芯片上必须点上何种 DNA，便要靠根底科学 (science) 来提供，两者是不一样的，但绝对相辅相成。,54,定磷法测定核酸的含量,DNA,含磷量平均为,9.9%RNA,含磷量为,9.5%,钼蓝比色法：,OD660,与含,P,量成正比,第四节：核酸,含量的测定,55,定糖法测定核酸的含量,当RNA与盐酸共热时核糖转变为糠醛，它与地衣酚反响呈绿色，最大吸收峰670nm。,DNA在酸性溶液中与二苯胺共热，其脱氧核糖参与反响生成蓝色化合物，测OD595。,56,准确的方法是紫外分光光度法。,但本法要求核酸样品是纯净的（即无显著的蛋白质、酚、琼脂糖或其它核酸、核苷酸等污染物的制品）。,用紫外分光光度计测定260,nm,和280,nm,两个波长处的光吸收，然后，按,IA260,相当于50,g,/,ml,双链,DNA。40,g,/,ml,单链,DNA,或,RNA,及20,g,/,ml,单链寡核苷酸。计算你的样品含量。,DNA,和,RNA,纯品的,A260/A280,的值分别为1.8和2.0，可将样品纯化后再作定量测定。,紫外分光光度法测定核酸的含量,57,谢谢！,58,谢谢,