香菇多糖提取工艺

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,香菇多糖提取,张志挺,14,生科一班,29,号,1,、香菇多糖,(1),香菇多糖结构式,分子式：,C,42,H,72,O,36,n,分子量：,n,(2),香菇多糖性质,香菇多糖（,lentinan;LNT,）是从香菇中分离纯化的一种葡聚糖，是以增强,T,细胞和巨噬细胞功能为主的免疫增强剂。,密度：,3,；沸点：,1472 at 760 mmHg,。,溶于碱溶液或甲酸，微溶于热水或二甲亚砜，不溶于冷水、醇、乙醚、氯仿、吡啶或六甲基磷酰胺。对硫酸和盐酸稳定。,(3),香菇多糖的功能,香菇多糖具有激活细胞免疫、调节多种体液免疫因子、诱导,-,干扰素生成，调节机体免疫应答反应，诱导白细胞对肿瘤浸润，导致肿瘤部位血管扩张、出血、坏死，阻止病毒与宿主细胞的结合，提高,SOD,超氧化物歧化酶,活性，抑制,MDA,丙二醛,生成，抗脂质氧化，降低胆固醇，调节糖代谢、改善糖耐量、扩张胃肠道产生饱腹感而减轻食欲，降低血糖等功能。,(4),香菇多糖的应用,、,香菇多糖在医药领域的应用,香菇多糖在治疗胃癌、结肠癌、肺癌等方面具有良好疗效。作为免疫辅助药物，香菇多糖主要用来抑制肿瘤的发生、发展与转移，提高肿瘤对化疗药物的敏感性，改善患者的身体状况，延长其寿命。,香菇多糖与化疗剂联合使用，有减毒、增效的作用。,香菇多糖配合其他药物治疗慢性乙型肝炎，可提高乙肝病毒标志物的转阴作用，减少抗病毒药物的副作用。此外，香菇多糖可用于治疗结核杆菌感染。,、,香菇,多糖在保健食品领域的应用,香菇多糖是一种特殊的生物活性物质，是一种生物反应增强剂和调节剂，它能增强体液免疫和细胞免疫功能。香菇多糖的抗病毒作用机制可能在于其提高感染细胞免疫力，增强细胞膜的稳定性，抑制细胞病变，促进细胞修复等功能。同时，香菇多糖还具有抗逆转录病毒活性。因此，香菇多糖是一种有待开发的抗流感的保健食品。,2,、香菇多糖的发展历史,(1),诞生与发展过程,1968,年,GoroChihara,首先从香菇子实体中浸提出,6,种香菇多糖,并证明其中一种具有明显的抗肿 瘤作用,定名为,Lentinan,1970,年,Chihard,和,Sasaki,用热水浸提结合有机溶剂沉淀从香菇中提取到另外,4,种多糖。,1986,年获日本厚生省批准生产并外销。,1988,年我国卫生部批准进口，现今我国已有几家国产,LNT,上市,(,如南京振中和福州梅峰等,),。香菇多糖由于是单一组分，质量易于控制，且具有疗效高，剂量低，毒副作用小等优点，受到医生的青睐。,自此,世界各地掀起了一股从大型真菌中寻找抗肿瘤药物的热潮。有关香菇多糖的研究尤其活跃,包括提取工艺及分离纯 化研究,香菇多糖理化性质及药用价值研究。但对多糖理化性质、结构、药效、药理等方面仍无定论,仍须继续深入研究。,(2),各种生产方法比较,主要的多糖提取方法有如下几种,:,热水浸提法、酸（碱）浸提法、微波提取法、超声波提取法、复合酶解法等等。,香菇多糖提取的工艺流程,多糖提取的常规工艺,原料预处理水,(,或酸,),浸提浸提物真空浓缩浓缩液酒精沉淀沉淀物,sevage,法脱蛋白水相丙酮洗涤多糖粗制品,采用复合酶解工艺,原料预处理,复合酶解酶解液真空浓缩浓缩液酒精沉淀沉淀物丙酮洗涤多糖粗制品,复合酶解、酸处理结合热水浸提法提取香菇多糖的改进工艺,原料预处理复合酶解,酶解液水浸提酸浸提浸提物空浓缩浓缩液酒精沉淀沉淀物,sevage,法脱蛋白,水相丙酮洗涤多糖粗制品,操作要点的对比,热水浸提法,向香菇处理物中加入,20,倍体积的蒸馏水,并在,40,水浴恒温下浸泡,4h,。放置冰箱冷冻柜中冷冻过夜。将香菇浸泡液从冰箱中取出,解冻后在恒温水浴箱内分别抽提,30,min,、,60,min,、,90,min,用,4,层纱布过滤后收集滤液。向滤渣中加入,20,倍体积的蒸馏水再抽提一次,沸煮时间同上用,4,层纱布过滤后收集滤液,合并两次滤液。,酸浸提法,向香菇处理物中加盐酸溶液使其最终浓度分别为,mol/L,、,mol/L,、,mol/L,置于,60,恒温水浴中浸提,8h,加适量的,NaOH,中和至中性,过滤,浓缩。,微波提取法,向香菇处理物中,按,1:25,加入去离子水浸泡过夜,粉碎,在一定微波条件下提取,冷却后离心,从上清液中取样测定其中多糖含量。,超声波提取法,向香菇处理物中,加入蒸馏水，进行超声波处理浸提。,8000r/min,离心五分钟，取上清液，用旋转蒸发仪浓缩至,1020ml,，加入两倍体积的无水乙醇，进行醇沉。放置过夜后再次离心，留取沉淀物，干燥至恒重。,复合酶浸提法,向香菇处理物的中加 纤维素酶和果胶酶,目的是为了酶解细胞表面结构及细胞间连接物,使其部分糖类物质的溶出。往酶解后的香菇处理物中加入,20,倍体积的蒸馏水,并在,40,水浴恒温下浸泡,80,min,。,迅速升温沸腾,90,min,后过滤得滤液。离心沉淀,上清液浓缩,乙醇沉淀。,复合酶解,酸与热水相结合浸提法,向香菇处理物中加 纤维素酶和 果胶酶,目的是为了酶解细胞表面结构及细胞间连接物,使其部分糖类物质的溶出。加,20,倍体积的水在,40,水浴恒温下浸泡,80,min,。后再迅速升温煮沸,60,min,用,4,层纱布过滤后收集滤液,再调节,pH,分别为、,5.5,进行酸浸提,然后再用,4,层纱布过滤后收集滤液。合并两次滤液。浓缩。,(3),现在常用的生产方法,以上几种方法均有优点和缺点，而现如今也都在被使用！,3,、生产技术,(1),生产原理,:,多糖溶于热水,不溶于,60%,以上乙醇,也不溶于氯仿正丁醇,.,热水浸提时，香菇组织膨胀破裂，多糖成分浸出，所以用热水提取,乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质,;,因为热水也可以将蛋白类物质提取出来,所以用氯仿正丁醇萃取除去提取液中的蛋白。,(2),原料及要求,:,将香菇清洗干净，除去其根部，将剩下的菌伞挤压，切小块放入真空干燥箱干燥，待香菇恒质量，放入粉碎机中粉碎，将粉碎后的香菇粉依次通过,40,，,60,，,80,，,100,目的筛子，得到,40,目以下、,40,60,目、,60,80,目、,80,100,目、,100,目粒度以上的样品，过筛之后把各级香菇粉分别装到清洁干燥的烧杯中，编号贴上标签，置于真空干燥箱中待用。,(3),工艺流程：,热水法提取香菇多糖工艺流程图,【,sevage,法脱蛋白,】,正丁醇、氯仿混合溶液（正丁醇：氯仿,=1,：,4,或,1,：,5,）和样物提取液混合并且振荡，不需要加热，利用离心机离心，直到离液面交界处无白色混悬，也就是蛋白质介于提取液与试剂交界处即可，最后分别提取即可。,(4),工艺流程说明及主要工艺参数,：,热水浸提,向香菇处理物中加入,20,倍体积的蒸馏水,并在,40,水浴恒温下浸泡,4h,。放置冰箱冷冻柜中冷冻过夜。将香菇浸泡液从冰箱中取出,解冻后在恒温水浴箱内分别抽提,30,min,、,60,min,、,90,min,用,4,层纱布过滤后收集滤液。向滤渣中加入,20,倍体积的蒸馏水再抽提一次,沸煮时间同上，用,4,层纱布过滤后收集滤液,合并两次滤液。,真空浓缩,将上述滤液用旋转蒸发器在大气压下进行浓缩,收集浓缩液。并用高速离心机在,6000rpm,离心,15min,目的是去除蛋白质和杂质,得上清液,。,酒精沉淀分离,在浓缩液中加入,4,倍体积的,95%,乙醇,使香菇多糖呈絮状凝胶物沉淀析出,而大部分蛋白质和其它成分保留在溶液中,再用高速离心机在,7000rpm,下离心,15min,得沉淀。,sevage,法脱蛋白,将上述沉淀溶于适量的蒸馏水中,分别加入,20%,体积的氯仿和,7%,体积的异戊醇生成絮状凝聚物,用高速离心机在,5000rpm,离心,15min,得沉淀。重复上述操作,直至无凝聚物生成。,丙酮洗涤脱水,将酒精沉淀物用丙酮洗涤脱水两次,倒入放有干燥滤纸的培养皿中,(,滤纸重,0.98g),然后将培养皿放在,50,的烘干箱中进行干燥,3h,得到香菇多糖粗制品。,粗多糖纯化,Sephadex G-100,凝胶充分溶胀后装柱，用蒸馏水平衡,48h,。取上述香菇多糖提取物溶于蒸馏水中，离心除去不溶物，上清液上柱分离，用蒸馏水洗脱，洗脱速度,5mL/20min,，,200nm,波长紫外检测，收集主要峰部分，冷冻干燥的白色香菇多糖，并称重。,(5),主要生产设备：,烧杯（若干），玻璃棒，温度计，锥形瓶（若干），漏斗，水浴锅，称量天平，台式恒温振荡器,台式离心机，紫外线分光光度计,(6),关键过程与关键技术,多糖的提取,取香菇,10g,，于组织捣碎机内粉碎，加入,20,倍量水，,90,水浴加热,30min,，抽滤，得滤液，加活性炭（,1mg/mL,），搅拌吸附,1h,，抽滤，得滤液，用氯仿萃取（,3,次）以除尽蛋白质，萃余液中加无水乙醇，使其乙醇最终浓度为,80%,，沉淀,12h,后，于离心机中离心（,4000r/min,）,30min,沉淀物分别用无水乙醇，丙酮，乙醚洗涤三次，既得香菇多糖提取物。,多糖纯化,凝胶柱层析原理：所谓层析，就是利用样品中各组成成分的理化性质的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，由于各组分随流动相前进的速率不同，从而把它们分离开来的技术。,操作步骤：,Sephadex G-100,凝胶充分溶胀后装柱，用蒸馏水平衡,48h,。取上述香菇多糖提取物溶于蒸馏水中，离心除去不溶物，上清液上柱分离，用蒸馏水洗脱，洗脱速度,5mL/20min,，,200nm,波长紫外检测，收集主要峰部分，冷冻干燥的白色香菇多糖，并称重。,香菇多糖分析检测,定性分析,苯酚,-,硫酸法,酚,-,硫酸试剂：酚,3g,，浓硫酸,5mL,，溶于,95mL,无水乙醇中，喷后，,110,加热几分钟，糖显棕色。,定量分析,分光光度法,A,标准曲线的制备,精密称取,60,干燥至恒重的甘露糖标准品，至于,100mL,量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，用移液管量取对照品溶液,0,、容量瓶中，加蒸馏水至刻度，再各精密吸取,1mL,，至于具塞试管中，准确移取,8%,苯酚溶液,1mL,，快速加入浓硫酸,5mL,，至于水浴中加热,15min,，取出冷却至室温，橘黄色由溶度从小到大而逐渐加深，将溶液于,490nm,波长的可见分光光度计处测定吸光度，绘制标准曲线。,B,样品多糖测定,精密城区香菇多糖，加水溶解，定量转移入,100mL,容量瓶中，加水至刻度，摇匀。准去吸取，按上述实验方法显色，测定吸光度，计算香菇多糖含量。,(7),该技术的优缺点：,优点：有可靠的生产数据，可大规模工业化生产，不易招致杂菌污染。,缺点,:,能耗高，设备要求高，提取时间长，高温可能会使多糖水解。,(8),该技术的改进之处：,增加浸提时间，使浸提过程得以充分；浸提后过滤时尽量趁热过滤，否则温度降低，物质间的粘度增大,过滤时间增长；浓缩过程受仪器影响较大，应选用较好的浓缩装置，如旋转蒸发仪等。,在实际生产中，为降低成本，提高效率，以上方法可结合应用，如热水浸提结合超声波；复合酶解、酸处理结合热水浸提法提取香菇多糖等等，这样提取效率比单一方法高许多。,thanks for,watching,