第五章 获得性免疫

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章 获得性免疫,第一节 概述,第二节 免疫预防及治疗,第三节 佐剂与免疫增强剂,第一节 概述,免疫接种是防治传染性疾病最重要的手段之一,尤其是在病毒性疾病的防制中,由于没有有效的药物进行防治,因而免疫防治显得更为重要。,免疫防治就是通过免疫的方法使动物具有针对某种传染病的特异性抵抗力,以达到控制疾病的目的。,15,世纪我国民间就流传着用良性天花患者的干燥痴皮磨成粉末后,用吹鼻法进行免疫预防。,琴纳,(Jenner),和巴斯德,(Pasteur),最早制备并使用疫苗接种动物,使之产生免疫力,有效地控制了天花、狂犬病、炭疽、霍乱、白喉等一些危害严重的疫病。,机体对病原微生物的免疫力分为先天性免疫和获得性免疫两种，前者是动物体在种族进化进程中得到的天然防御能力，后者是动物体在个体发育过程中受到病原体及其产物刺激而产生的特异性免疫力。,特异性免疫 又分为主动免疫和被动免疫两种。用疫苗对动物进行免疫接种经主动免疫方式使动物获得免疫力，是预防和控制动物传染病的重要手段和中心工作。,获得性免疫的类型：,第二节 免疫预防及治疗,天然获得性免疫,(Natural Acquired immunity),是指个体动物本身未经免疫接种而具有的对某些疫病的特异性抵抗力。其包括,天然被动免疫,和,天然主动免疫,两种类型。,一、,天然被动免疫,概念,新生动物通过母体胎盘、初乳或卵黄从母体获得某种特异性抗体,从而获得对某种病原体的免疫力。,意义,保护胎儿免受病原体的感染；,抵御幼龄动物传染病,在初乳中的,lgG,、,IgM,可抵抗败血性感染,IgA,可抵抗肠道病原体的感染。,母源抗体可干扰弱毒疫苗对幼龄动物的免疫效果,是导致免疫失败的原因之一。,二、,天然主动免疫,概念,是指动物在感染某种病原微生物时过后产生的对该病原体再次侵入的不感染状态,或称为抵抗力。,人工获得性免疫,概念,是指人为地对动物进行免疫接种,使动物具有对某种抗原,(,病原体或其它抗原物质,),的特异性免疫力,其包括,人工被动免疫和人工主动免疫,两种类型。,生物制品,生物制品,指用于动物传染病预防、诊断、治疗的生物制剂。包括疫苗、诊断液、免疫血清。,（一）疫苗,用于人工自动免疫预防动物传染病的生物制剂。包括弱毒活疫苗、灭活疫苗、类毒素和新型疫苗等。,（二）诊断液,用于传染病免疫学诊断的生物制剂。包括诊断抗原、诊断抗体、冻干补体等。,（三）免疫血清,用于传染病免疫防治的含有高效价抗体的动物血清制剂。包括抗菌血清、抗病毒血清、抗毒素、康复血清、高免蛋黄抗体等。,三、人工被动免疫,将免疫血清或自然发病后康复动物的血清人工输入未免疫的动物,使其获得对某种病原的抵抗力,这种免疫接种方法称为人工被动免疫,(Artificial Passive Immunity),。,采用人工被动免疫注射免疫血清可使抗体立即发挥作用,无诱导期,免疫力出现快。但免疫力维持时间短,一般维持,1,4,周。,免疫血清,可用同种动物或异种动物制备,用同种动物制备的血清称为同种血清,而用异种动物制备的血清称为异种血清。,除了用免疫血清进行人工被动免疫外,在家禽还常用,卵黄抗体,制剂进行人工接种,进行紧急防治。,(,鸡传染性法氏囊病,(IBD),雏鸭病毒性肝炎,),抗毒素血清,类毒素免疫动物,获取含高效价抗毒素的血清,用饱和硫酸铵,(48,),处理,使抗毒素球蛋白部分得到浓缩和提纯。用破伤风毒素进行攻击天竺鼠来测定抗毒素的保护剂量,并与国际标准制剂进行对照。,一个破伤风抗毒素的国际单位,(I.U.),是指国际标准的破伤风抗毒素所含的特异性中和活性。,四,、人工主动免疫,给动物接种抗原物质,刺激机体免疫系统发生应答反应,产生特异性免疫力。,有一定的诱导或潜伏期,出现免疫力的时间与抗原种类有关,在免疫防治中应着重考虑到这一特点。,人工主动免疫产生的免疫力持续时间长,免疫期可达数月甚至数年,而且有回忆反应,某些抗原免疫后,可产生终生免疫,(,如布氏流产杆菌,19,号菌株,),。,(,一,),群体免疫力,是指在动物群体中,由于存在着一定比例的免疫动物,使整个动物群体具有对某种疾病的抵抗力。,(,二,),疫苗的种类,活苗、死苗、代谢产物和亚单位疫苗,以及生物技术疫苗。,生物技术疫苗包括基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、抗独特型疫苗,基因工程活疫苗以及,DNA,疫苗等。,人工自动免疫,人工被动免疫,常规疫苗,新型疫苗,疫苗（活疫苗、死疫苗）,类毒素,自身疫苗,亚单位疫苗,化学疫苗,多肽疫苗,基因工程疫苗,基因疫苗,抗抗体疫苗,特异性免疫治疗剂,免疫调节剂,抗毒素,抗病毒血清,抗菌血清,免疫球蛋白制剂,免疫核糖核酸,转移因子,白细胞介素,胸腺素等,1,、活苗,有强毒苗、弱毒苗和异源苗三种,强毒苗,是应用最早的疫苗种类。使用强毒进行免疫有较大的危险,所以应摒弃,但在有些特殊情况下,使用强毒活苗也能取得较好的防治效果,(,鸡传染性喉气管炎泄殖腔刷种,),可在一定程度上控制疫情,但应强调免疫的过程也是散毒的过程,因而使用时应慎重。,弱毒苗,毒力已经致弱,但仍然保持着原有的抗原性,并能在体内繁殖,因而可用较少的免疫剂量诱导产生坚实的免疫力,而且不须使用佐剂,免疫期长。,不影响动物产品,(,肉类,),的品质。,有些弱毒苗可刺激机体细胞产生干扰素,对抵抗其它野毒的感染也是有益的。,贮存与运输的不便,而且保存期较短,将其制成冻干苗可延长保存期,.,大多数弱毒苗是通过人工致弱强毒面制成的,致弱方法是使强毒株在异常的条件下生长繁殖,使其毒力减弱或丧失,(,炭疽芽胞苗,/,禽霍乱疫苗,),。,病毒疫苗弱毒株通常是用鸡胚、细胞培养或实验动物接种传代制成的,。例如我国培养成功的猪瘟免化弱毒苗,毒力极弱,免疫原性优良,被多个国家引进使用。,将哺乳动物的病毒接种于鸭胚也是使毒力致弱的常用方法,将病毒在不适应的细胞中培养也可致弱病毒毒力。,致弱后的疫苗株应毒力稳定,严防毒力返强,因此多用高代次的疫苗株制苗,例如,:,牛瘟兔化苗,400,代以后,猪瘟兔化弱毒苗,370,代以后,而且在多次传代后仍维持原有的免疫原性。,异源苗,是用具有共同保护性抗原的不同种病毒制备成的疫苗。,火鸡疱疹病毒,(HVT),鸡马立克氏病病毒,鸽痘病毒 鸡痘病毒。,麻疹 牛瘟 犬瘟热病毒,;,牛病毒性腹泻病毒 猪瘟病毒,;,火鸡疟疾病毒 马立克氏病病毒,;,牛瘟兔化毒 鸡新城疫病毒。,活苗会出现异种微生物或同种强毒污染的危险,经接种途径人为地传播疾病。,2.,死苗,概念,病原微生物经理化方法灭活后,仍然保持免疫原性,接种后使动物产生特异性抵抗力,这种疫苗称为死苗或灭活苗。,使用接种剂量较大,免疫期较短,需加入适当的佐剂以增强免疫效果。死苗的优点是研制周期短、使用安全和易于保存。,组织灭活苗 油佐剂灭活苗 氢氧化铝胶灭活苗,病变组织灭活苗,是用患传染病的病死动物的典型病变组织,经碾磨、过滤、按一定比例稀释并加入灭活剂灭活后制备而成的。,鸡胚组织灭活苗,是用病原接种鸡胚后,经一定孵育时间收获除卵黄外的所有胚组织、经碾磨、过滤、灭活后制备而成。,油佐剂灭活苗,是以矿物油为佐剂与经灭活的抗原液混合乳化制成的。,吐温,-80,司本,-80,硬脂酸铝,氢氧化铝胶灭活苗,(,铝胶苗,),是将灭活后的抗原液加入氢氧化铝胶制成的,。,灭活的机理及方法,实际生产中,最常用的灭活剂,为,甲醛溶液,灭活机制,是作用于蛋白质的氨基和酰胺基以及核酸中嘌呤和嘧啶上的非氢键氨基基团,形成交联,使其结构固定并丧失活力。,丙酮和乙醇,是使蛋白质变性较温和的灭活剂,在制备羊跳跃病疫苗,(,Louping,-ill vaccine),时,用乙醇灭活该病病毒可增加疫苗的抗原性,其作用机理尚不清楚。,烷化剂,也是常用的灭活剂,其作用机理是通过使核酸交联,杀死微生物,由于在灭活过程中不改变微生物的表面蛋白成分,所以其抗原性不受影响。,另外,用于动物疫苗的灭活剂还包括氧化乙烯、乙烯亚胺、乙酸乙烯亚胺及,-,丙酮内脂等。,3.,代谢产物和亚单位疫苗,细菌的代谢产物如毒素、酶等都可制成疫苗,破伤风毒素、白喉毒素、肉毒毒素经甲醛灭活后制成的类毒素有良好的免疫原性,可作成主动免疫制剂。另外,致病性大肠杆菌肠毒素,多杀性巴氏杆菌的攻击素和链球菌的扩散因子等都可用作代谢产物疫苗。,亚单位疫苗是将病毒的衣壳蛋白与核酸分开、除去核酸用提纯的蛋白质衣壳制成的疫苗,。,无不良反应,使用安全,效果较好。制备困难,价格昂贵。,猪口蹄疫、伪狂犬病、狂犬病、水泡性口炎、流感等亚单位疫苗。,致病性大肠杆菌,K88,疫苗用于口服,可阻止致病性大肠杆菌在肠粘膜表面的附着作用,对大肠杆菌病的防制有一定作用。,4.,生物技术疫苗,类型,基因工程亚单位疫苗 合成肽疫苗 抗独特型疫苗,基因工程活疫苗,DNA,疫苗,(1),基因工程亚单位疫苗,是用,DNA,重组技术,将编码病原微生物保护性抗原的基因导人受体菌,(,如大肠杆菌,),或细胞,使其在受体细胞中高效表达,分泌保护性抗原肽链。提取保护性抗原肽链,加入佐剂即制成基因工程亚单位疫苗。,(2),合成肽疫苗,是用化学合成法人工合成病原微生物的保护性多肽并将其连接到大分子载体上,再加入佐剂制成的疫苗。,(3),抗独特型疫苗,(4),基因工程活疫苗,类型,有缺失疫苗和活载体疫苗二类。,基因缺失疫苗,概念,用基因工程技术将强毒株毒力相关基因切除构建的活疫苗,该苗安全性好、不易返祖,;,特性,免疫接种与强毒感染相似,机体可对病毒的多种抗原产生免疫应答,;,免疫力坚实,免疫期长,尤其是适于局部接种,诱导产生粘膜免疫力,因而是较理想的疫苗。,活载体疫苗,是用基因工程技术将保护性抗原基因,(,目的基因,),转移到载体中使之表达的活疫苗。目前有多种理想的病毒载体,如痘病毒,腺病毒和疱疹病毒等都可用于活载体疫苗的制备。国外已研制出以腺病毒为载体的乙肝疫苗、以疱疹病毒为载体的新城疫疫苗等。,(5) DNA,疫苗,应用基因工程技术把编码保护性抗原的基因与能在真核细胞中表达的载体,DNA,重组,这种目的基因与表达载体的重组,DNA,可直接注射,(,接种,),到动物,(,如小鼠,),体内,目的基因可在动物体内表达,刺激机体产生体液免疫和细胞免疫,。,(,三,),多价苗与联苗,多价苗,指将同一种细菌,(,或病毒,),的不同血清型混合制成的疫苗。譬如巴氏杆菌多价苗,大肠杆菌多价苗等。,联苗,指由两种或两种以上的细菌,(,或病毒,),联合制成的疫苗。一次免疫可达到预防几种疾病的目的。譬如猪瘟,-,猪丹毒,-,猪肺疫三联苗,新城疫,-,减蛋综合征,(EDS-76)-,传染性法氏囊病三联苗等。,五、疫苗的使用,(,一,),免疫途径,滴鼻和点眼、刺种、注射、饮水和气雾等,应根据疫苗的类型、疫病特点及免疫程序来选择每次免疫的接种途径,。,滴鼻与点眼,免疫效果较好,仅用于接种弱毒疫苗,苗毒可直接刺激眼底哈氏腺和结膜下弥散淋巴组织,另外还可刺激鼻、咽、口腔粘膜和扁桃体等,饮水免疫,适用于大型鸡群,饮水免疫只有当苗毒接触到鼻咽部粘膜时,才引起免疫反应,进入腺胃的苗毒在较酸的环境中很快死亡,失去作用。,饮水免疫的免疫效果很差。不适于初次免疫。,刺种与注射,适于某些弱毒苗如鸡瘟与马立克氏病免疫。另外灭活苗的免疫也必须用注射的方法进行。,刺种与注射方法免疫确实,效果好,。,气雾免疫,在新城疫免疫中,气雾免疫效果较好,不仅可诱导产生循环抗体,而且也可产生局部免疫力,但气雾免疫会造成一定程度的应激反应,容易引起呼吸道感染,。气雾引起的应激反应程度与雾粒的大小成反比。,因此在有呼吸道病史的鸡场,更适于采用较大雾滴的气雾免疫。,（二）、免疫程序,免疫程序应根据疫病在本地区的流行情况及规律、畜禽的用途,(,种用、肉用或蛋用,),、年龄、母源抗体水平和饲养条件，以及使用疫苗的种类、性质、免疫途径等方面的因素制定，不宜作统一规定。免疫程序应随情况的变化而作适当的调整，不存在普遍适用的最佳免疫程序。动物的抗体监测是重要的参考依据。,在制订免疫程序时应考虑到本地区的疫病流行情况,畜禽种类、年龄,饲养管理水平,母源抗体干扰,疫苗的性质、类型、免疫途径等各方面的因素。,以新城疫与传染性法氏囊的免疫为例：,新城疫首免日龄的确定,要考虑到母源抗体的干扰,用血凝抑制,(HI),试验测定,1,日龄雏鸡的母源抗体水平,以此推算首免同龄,雏鸡体内的,HI,抗体的半衰期为天,首免日龄可推算如下,:,ND,首免日龄,=4.5(1,日龄,HI,抗体以,2,为底的对数值, 4),5,。,例如雏鸡,1,日龄的,HI,抗体平均滴度为,32,那么,log,2,32,5,根据公式计算首免日龄为,4.5(5-4),5=9.5(,日龄,),如果,1,日龄雏鸡的,HI,抗体滴度低于,16,1,日龄就应首免。以蛋鸡为例,首免,(7,10,日龄,),用,IV,系或克隆,-30,进行滴鼻、点眼接种,二免,(25,30,日龄,),用,系或克隆,-30,进行肌肉注射接种,同时注射半剂量,(0.25ml),的油佐剂灭活苗。,110,120,日龄注射油佐剂灭活苗。,2.,传染性法氏囊病,(IBD),IBD,免疫的首免日龄非常重要,一般通过测定,1,日龄雏鸡的母源抗体水平来确定,。,如果,1,日龄鸡群的母源抗体琼扩阳性率达不到,80,则应在,10,17,日龄进行首免,;,若阳性率在,80,以上,应在,7,10,日龄采血再进行一次检测,若此次阳性率低于,50,则应在,14,21,日龄首免,如果超过,50,则在,17,24,日龄接种。,首免后,2,3,周进行二免,(,与首免相同都以弱毒苗进行饮水免疫,),。,如果是种鸡,还应在,18,20,周龄及,40,42,周龄进行两次油佐剂灭活苗接种,以保护仔代防止早期感染,若是商品用蛋鸡则可省去灭活苗免疫过程。,六,、免疫失败,免疫失败的因素,1,、遗传因素,动物机体对接种抗原的免疫应答在一定程度上是受遗传控制的,因此不同品种,甚至同一品种不同个体的动物,对同一种抗原的免疫反应强弱也有差异。,2,、营养状况,动物的营养状况也是影响免疫应答的因素之一。维生素、微量元素及氨基酸的缺乏都会使机体的免疫功能下降。,3,、环境因素,环境因素包括动物生长环境的温度、湿度、通风状况,环境卫生及消毒等。,4,、 疫苗方面,疫苗是预防疫病的重要武器,动物的特异性免疫力与疫苗有直接关系。,5,、 血清型,针对多血清型的疾病应考虑使用多价苗。,6,、 疾病对免疫的影响,有些疾病严重影响疫苗的免疫效果,引起免疫抑制。,7,、 母源抗体,弱毒苗在免疫动物时,如果动物存在较高水平的母源抗体,会极大地影响疫苗的免疫效果。,8,、,病原微生物之间的干扰作用,同时免疫两种或多种弱毒苗往往会产生干扰现象,例如传染性支气管炎病毒,(IBV),对新城疫疫苗的免疫有干扰作用。,免疫失败的疫苗因素,1.,疫苗的质量,弱毒苗接种后在体内有个繁殖过程,因而接种的疫苗中必须含有足够量的有活力的病原,否则会影响免疫效果。,灭活苗接种后没有繁殖过程,因而必须有足够的抗原量作保证,才能刺激机体产生坚实的免疫力。,油佐剂灭活苗的性状必须稳定,良好的油佐剂灭活苗是均匀的乳白色,粘稠度适中,若出现油水分层现象时,应废弃,否则影响免疫效果。,2.,疫苗的保存与运输,湿苗应低温冻结保存,弱毒冻干苗应保存于,2,8,马立克细胞结合毒疫苗应在液氮中保存,。,灭活苗应贮存于,2,8,严防冻结,3.,疫苗的使用,在疫苗的使用过程中,有很多因素影响免疫效果,例如疫苗稀释方法,水质,雾粒大小,(,气雾免疫,),、接种途径,免疫程序等都是影响免疫效果的重要因素,各环节都应给予足够的重视。,第三节 佐剂,免疫增强剂,是指单独使用即能引起机体出现短暂的免疫增强作用,这与佐剂是不同的。然而有些物质具有双重作用。免疫增强剂的种类繁多,按性质不同可分为生物性免疫增强剂、细菌性免疫增强剂、化学性免疫增强剂、中药免疫增强剂等,一、概论,凡是可以增强抗原特异性免答的物质均称为佐剂。,1,、佐剂的定义,(adjuvant）一词来源于拉丁语，原为辅助之意。在免疫学和生物制品学上又称为免疫佐剂（immunologic adjuvant）。传统的概念为：当一种物质先于抗原或与抗原混合或同时注射于动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥其辅佐作用者，都称之为佐剂。,2、作用特点,能明显增强多糖或多肽等抗原性微弱的物质诱导机体产生特异性免疫应答；,用最少量的抗原和最少的接种次数刺激机体可产生足够的免疫应答和高滴度的抗体，在血流或粘膜表面能维持较长的时间，发挥持久的效果。,3、佐剂的作用,改变正常免疫机能，吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原；,改变抗原的构型，使抗原物质降解并加强其免疫原性；,延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和缓释，并发挥免疫系统的细胞间协同作用（巨噬细胞与,T,细胞，,T,细胞与,B,细胞）。,4、作用机理,抗原递呈（,antigen presentation,）,指抗原分子递呈给,T,细胞的方法。抗原递呈的方法对免疫应答的实质和强度有重要影响。佐剂与疫苗的联合使用，有助于抗原性物质在胞内被加工，被,MHC,分子特异性的结合、保护、运输并递呈给效应细胞。,抗原寻的（,antigen targeting,）,指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。佐剂对于抗原寻的涉及到的一系列机制，包括吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原与细胞受体的结合等有重要作用。,免疫调节（,immune modulation,）,是指任何可以修饰的免疫效应细胞对抗原或表位进行加工的机制。通过这种机制，可以改变特异性免疫应答的本质或强度。,T细胞有Th1和Th2两个亚类。同一抗原和不同佐剂一起使用能够引起不同的免疫反应。因此，通过筛选特定的佐剂，可以达到诱导正确的免疫应答的目的。,二、佐剂分类,按佐剂物理性质，分为颗粒型佐剂和非颗粒型佐剂；,按佐剂的生物学性质（即,Ballanti,分类法），可分为微生物及其组分与非微生物物质；,按佐剂在体内存留的时间，则可分为贮存型佐剂（,depot type adjuvant,）和非贮存型（,non-depot type adjuvant,）。,颗粒型佐剂多半属于贮存型的，非颗粒型佐剂大多属于非贮存型佐剂。,（一）颗粒性佐剂,1,盐类佐剂：包括氢氧化铝胶、各种明矾、磷酸铝等。,2,油水乳剂佐剂 ：如弗氏完全佐剂（,Freunds complete adjuvant, FCA,）、弗氏不完全佐剂（,Freunds incomplete adjuvant, FIA,）和矿物油白油佐剂。,3,免疫刺激复合物（,ISCOM,）佐剂。,4,蜂胶佐剂（,propolis,）。,5,脂质体佐剂（,liposomes,）。,6,其他：,MF59,佐剂、微囊化佐剂（,microencapsulation,）、硬脂酰酪氨酸佐剂（,slearyltyrosine,）和,菊粉（,gamma-inulin,）等。,（二）非颗粒性佐剂,1,肽类佐剂（,peptides,）：如胞壁酰二肽（,MDP,）及其衍生物、去胞壁酰多肽（,desmuramyl peptides,）、脂肽（,lipopeptides,）和免疫调节多肽（,immunomodulatory peptides,）等。,2,表面活性分子类佐剂（,surface-active molecules,）：如非离子阻断共聚物表面活性剂（,nonionic block copolymers,）和海藻糖合成衍生物（,TDM,）等。,3,核酸及其衍生物类佐剂（,nucleic acid derivatives,）：如合成核苷酸聚合体（,synthetic olynucleotides,）、次黄嘌呤衍生物（,hypoxanthine derivatives,）和免疫刺激序列,DNA,（,CpG DNA,或,CpG,寡聚脱氧核苷酸（,CpG-ODN,）等。,4,含硫复合物类佐剂（,suiphur-containing compounds,）：如左旋咪唑（,levamisole,）。,5,碳水化合物高分子类佐剂（,carbohydrate polymers,）：如香菇多糖（,lentinan,）、硫酸多糖（,sulfated polysaccharides,）等其他一些多糖和,DEAE-,葡聚糖等。,6,细胞因子类佐剂（,cytokine,）：如白介素,-1,（,IL-1,）、白介素,-2,（,IL-2,）、白介素,-4,（,IL-4,）和,-,干扰素（,-IFN,）等。,7,脂质分子类佐剂（,lipid molecules,）：如脂多糖及其衍生物（,lipopolysaccharide derivatives,），一些脂溶性维生素（,fat-soluble vitamins,）如维生素,A,和维生素,E,等。,8,其他：包括一些蛋白毒素如霍乱毒素（,CT,）、百日咳毒素（,PT,）和破伤风类毒素（,TT,）等；脂磷壁酸（,LTA,）；维生素,B12,等。,常规佐剂和新型免疫佐剂,目前，铝盐类佐剂、油水乳剂佐剂和蜂胶佐剂等比较常用，属于常规佐剂。,细胞因子类佐剂、 CpG DNA、基因工程减毒素、免疫刺激复合物佐剂、脂质体佐剂及MF59佐剂等是目前研究的热点，其中有些也已经开始用于生产实际，属于新型免疫佐剂。,三、常规免疫佐剂,（一）铝盐类佐剂,该类佐剂在生物制品上应用广泛，对体液免疫作用很明显，与抗原混合注射时，可通过抗原寻的过程显著增高抗体滴度。可溶性抗原与此类佐剂混合后成为凝胶状态，可建立一个短时的贮存颗粒，将可溶性抗原转化为一种便于吞噬的形式，以利于巨噬细胞吸附。,1氢氧化铝胶,又称铝胶，其佐剂活性与质量密切相关，质优的铝胶分子细腻、胶体性良好、稳定，吸附力强，保存两年后其吸附力不变。铝胶可用于制造多种兽用疫苗。各厂家采用不同的合成方法制备铝胶，优点各异。,制法,（,1,）用铝粉加烧碱合成法：用量按下列反应式计算：,2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4Al2(SO4)318H2O,A12(SO4)318H2O+6NaOH2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O,（,2,）用明矾加碳酸钠合成法：用量按下列反应式计算：,2 KAl(SO4)2+3Na2CO3+3H2O2Al(OH)3+3Na2SO4+3CO2,。,（,3,）用三氯化铝与氢氧化钠合成：,A1C13+3NaOHAl(OH)3+3NaCl,。此法合成的铝胶含量低，透明无沉淀，目前广泛用于制备人用生物制品，认为佐剂效果良好，注射部位无硬结反应。,配制时注意事项：,氢氧化铝具有较强的吸附力，所以，制胶过程中一般用软化水或去离子水洗涤。,氢氧化铝胶为两性化合物，过酸或过碱都会失去胶态。故要掌握好化合时的,pH,值。,贮存铝胶应放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，并严密封盖，贮放期不超过,3,个月。,铝胶室温保存，以免破坏胶态。,2明矾（Alum）,有钾明矾（,KAl,（,SO4,）,212H2O,）和铵明矾（,AlNH2,（,SO4,）,212H2O,）两种。,作为佐剂用于生物制品的主要是钾明矾（即硫酸铝钾）。,制造时，先将灭活菌液调至土，选精制明矾制成,10,溶液，高压灭菌后，冷至,25,以下备用。按菌液量加入明矾溶液,1,2,，充分振荡，然后沉淀。,佐剂作用与氢氧化铝胶近似，但该法较简便，应用较广，如破伤风明矾沉淀类毒素和气肿疽明矾灭活疫苗等。,在美国只有明矾可在人体中应用。,3磷酸三钙,在疫苗中加入氯化钙和磷酸氢二钠，使在疫苗中化合成磷酸三钙，吸附抗原后沉淀，所制出的几种疫苗免疫效果良好。此法简便，质量稳定。,铝盐类佐剂成本低廉，使用方便，安全性较好，已被广泛用于兽用疫苗，乙肝、白喉等重组疫苗的佐剂。,缺点：,轻度局部反应，可形成肉芽肿，个别形成局部无菌性脓肿；,铝胶疫苗怕冻，冻后铝胶易变性；,有可能对人、畜神经系统有影响；,主要激活,Th2,免疫细胞，诱导体液免疫应答。而诱导细胞介导的免疫应答作用不明显。只适用于以抗体为主要保护性免疫的疾病的疫苗，如白喉、破伤风、乙肝、麻疹等。,（二）油乳佐剂,指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂，如弗氏佐剂。,该类佐剂主要在抗原寻的过程中起作用，使抗原在注射部位保持稳定，为抗原在淋巴系统中转运提供载体，增加单核细胞的形成和积聚。油乳剂疫苗的免疫效力高低，直接与乳化作用的好坏和乳剂成分的质量等有关。,一种好的乳剂疫苗应是油包水（水,/,油或,W/O,）或水包油（油,/,水或,O/W,）型，粘度低，颗粒均匀，稳定性良好，呈乳白色。,1乳剂的概念,“乳剂”是将一种溶液或干粉分散成细小的微粒，混悬于另一不相溶的液体中所成的分散体系。被分散的物质称为分散相（内相），承受分散相的液体称连续相（外相），两相间的界面活性物质称为乳化剂。,当以水为分散相，以加有乳化剂的油为连续相时，制成的乳剂为,W/O,型，反之为,O/W,型。,W/O型、O/W型乳剂比较,制成什么样的乳剂型，与乳化剂及乳化方法密切相关。,通常,W/O,型乳剂较粘稠，在机体内不易分散，佐剂活性较好，为生物制品所采用的主要剂型；,O/W,型乳剂较稀薄，注入机体后易于分散，但其佐剂活性很低，生物制品一般不采用这种剂型。,2乳化剂,（1）乳化剂的种类,天然乳化剂：来自动植物，如阿拉伯胶、海藻酸钠、蛋黄以及炼乳等。,人工合成乳化剂，再分为离子型和非离子型。,离子型乳化剂,阴离子型：如碱肥皂、月桂酸钠、十二烷基磺酸钠和硬脂酸铝等，多用于乳化一般生物制剂；,阳离子型：阳离子类乳化剂有氯化苯甲烃铵、溴化十六烷三甲基和氯化十六烷铵代吡啶等，用于制备一般的水包油生物制剂。,非离子型乳化剂,多数是多元醇或聚合多元醇的脂肪酸脂类或醚类物质，如月桂酸聚甘油脂、山梨醇脂和单油酸脂等。它们具有一定的亲水性和亲油性基团，为制造医药或化妆品的乳化剂。制备注射用油乳剂灭活疫苗，最适用的乳化剂有,去水山梨醇单油酸酯（其中，司本,-80,和,Arlacel-A,是同类产品）、,聚氧乙烯去水山梨醇单油酸酯（商品名吐温,-80,）和硬脂酸铝等。,（,2,）乳化剂的选择,通常可根据用途，依据乳化剂的,HLB,值（亲水亲油平衡值）进行选择。乳化剂的,HLB,值与其在水中的溶解度相关；,亲油性的在水中溶解度小，,HLB,值低，易形成油包水型油乳剂。,HLB,值为,4,6,的乳化剂适用于制造,W/O,型油乳剂；常用的司本,-80,，,HLB,值为，在水中溶解度低，不易在水中分散，溶于多种有机溶剂，性质稳定，易形成,W/O,型油乳剂；,亲水性强的在水中溶解度大，,HLB,值高，容易形成水包油型油乳剂；,HLB,值在,8,18,的乳化剂适用于,O/W,型油乳剂。吐温,-80,，其,HLB,值为，易溶于水，易形成,O/W,型油乳剂。,3白油佐剂,制苗用的白油应无多环芳烃化合物、粘度低、无色、无味和无毒性。,Drakocel-6VR,、,Marcol-52,和,Lipolul-4,是国内外常用的制苗用白油。,我国目前选用杭州炼油厂的,7,号或,10,号白油和北京石油化工科学研究院的合成白油，其质量标准为：无色无味，,50,运动粘度,7m,2,s,左右，紫外吸收值（,250,350nm,），紫外消光系数,1210,8,；单环芳烃与双环芳烃含量低于，无多环芳烃；,小鼠腹腔注射或家免皮下注射白油，观察,60d,，表现正常。,4乳剂配方与乳化方法,使用不同乳化剂和不同的配合比例及乳化方法，决定了制备乳剂的性状和稳定性。疫苗生产中主要有两种基本方法。,（,1,）剂在水中法：此法将乳化剂直接溶于水中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生成,O/W,乳剂。若欲得,W/O,型，可继续加入油，直到发生变型。该法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅拌而得到较好的乳剂。,（,2,）剂在油中法：,此法将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，继续加入至变型。该法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在左右，比较稳定。,免疫实验动物用的佐剂,其配方按容量计为：,矿物油（白油）,75%85,，,乳化剂,15,25%,，混合后经除菌过滤而成为弗氏不完全佐剂（,FIA,）；如向其中加入,m1,死结核杆菌即为弗氏完全佐剂（,FCA,）。,使用时，将含抗原的水相，与上述任一佐剂等量混合，用力振摇即可成为均匀的乳剂。,也可用,9,份油和,1,份司本,-80,混合后加,2,吐温,-80,和,1,2%,硬脂酸铝，经高压灭菌后备用，注射前将配好的油佐剂与抗原水相,1,：,1,混合，强力振摇，可配制成性状良好的乳剂疫苗。,副作用,弗氏佐剂具有高度佐剂活性，因而应用广泛。但因副作用强烈而限制其应用。很少用于动物免疫。,油通过肌膜层造成组织损伤，局部形成结节和无菌性脓肿。,加入了结核菌素，能使,PPD,试验阳性。可能致癌；,过于粘稠，难以注射。,大量生产,可将,94,白油与,6,司本,-80,混合后加,1%2,硬脂酸铝，灭菌后即为油相；,将抗原液加,2,4%,吐温,-80,为水相。,乳化时，将油相与水相按,3,：,12,：,1,比例配制，先缓速混合，再通过胶体磨充分乳化，可获得稳定的油包水乳剂苗。,双相乳剂疫苗：将粘稠的,W/O,乳剂疫苗，再加,2,吐温,-80,生理盐水，通过搅拌或胶体磨乳化，可制成双相乳剂疫苗（水,-,油,-,水乳剂或称多型乳剂,Multiple emulsion adjuvant,）。,优点是：粘稠度低、在注射部位易分散、局部反应轻微及佐剂效应良好等。,5油乳剂检验,生产实际中以粘度测定和稳定性测定为主。,（,1,）粘度测定：最简易的方法是取内口直径为的吸管，在室温下吸满,lml,乳剂，垂直放出所需时间作为粘度单位，以,0.4ml 2,6S,为合格，不得多于,10,15S,，否则注射时就比较困难。也可用,Saybolt,粘度计。,（,2,）乳剂稳定性测定：加速老化法：疫苗于,37,贮存,10,30d,不破乳。离心加速分层法：在一个半径为,10cm,的离心器中装油乳剂，,3 000rpm,离心,15min,不分层，相当于保存,1,年以上不破乳。,（三）蜂胶佐剂,1,蜂胶的理化特性与质量标准,蜂胶（,Propolis,）是蜜蜂采自柳树、杨树、栗树和其它植物幼芽分泌的树脂，并混入蜜蜂上颚腺分泌物，以及蜂蜡、花粉及其它一些有机与无机物的一种天然物质，含有多种黄酮类、酸类、醇类、酚类、脂类、烯烃和萜类等化合物及多种氨基酸、酶、多糖、脂肪酸、维生素及化学元素，是一种优良的天然药物。,2,蜂胶的佐剂作用,蜂胶具有广泛的生物活性和药理作用。,具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎、增强机体免疫功能和促进组织再生等作用。,蜂胶具有良好的免疫增强作用。它能保持抗原特性，增强巨噬细胞的吞噬能力，促进抗体的产生，提高机体的特异性和非特异性免疫力。,3,蜂胶佐剂疫苗制备方法,（,1,）蜂胶的处理：用市售蜂胶，放,4,以下低温贮存，用前在,4,8,下粉碎，过筛，按,1,：,4,（,W/V,）加,95,的乙醇，室温浸泡,24,48h,，冷却，过滤或离心取上清，即得透明栗色纯净蜂胶浸液。除去干渣计算出浸液中含蜂胶量，浸液,4,以下保存备用。,（,2,）蜂胶佐剂疫苗的制备,（以禽霍乱蜂胶疫苗为例）：将纯净培养的鸡多杀性巴氏杆菌液，经甲醛灭活后，加入蜂胶乙醇浸液，使每毫升菌液中含蜂胶,10mg,，边加边摇荡，迅即成为乳浊状，即为蜂胶佐剂疫苗。,四、细胞因子类佐剂,1979,年第,2,届国际淋巴因子会议命名第,1,个细胞因子白细胞介素,2,（,interleukin-2,，,IL-2,）,在机体免疫系统活动过程中，有许多种体液性免疫分子和细胞因子参与。,前者如免疫球蛋白、补体和胸腺肽类。,后者作为免疫活性细胞间相互作用的介质和强有力的蛋白性调节因子，可以调节免疫反应、炎性反应、组织修复、组织移植反应和造血。,（一）细胞因子的概念与分类,细胞因子（cytokine）是机体的各种细胞在其生命周期中所释放的具有不同生物学效应的物质，是免疫细胞间相互作用的调节信号。该类物质相互诱生，相互影响，构成一个巨大的细胞因子网络（cytokine network）系统，各种细胞借助自己所释放的细胞因子完成各自的功能，在免疫应答中发挥作用。,分类,一类为经典的细胞因子，包括淋巴毒素（,LT,）、肿瘤坏死因子（,TNF,）、和干扰素（,INF,）等；,另一类为对体液免疫和细胞免疫具有调节作用的因子，其代表为白细胞介素（,IL,）和集落刺激因子（,CSF,），可以促进和抑制免疫应答。,绝大多数的细胞因子的分子量小于,25KD,，分子量最低者如,IL-8,仅,8KD,。,多数细胞因子以单体形式存在，少数以双体形式发挥生物学作用。,（二）细胞因子的作用特点,1,多效性：,免疫调节作用的多样性：如,IL-6,除参与,B,细胞的分化、增值调节、抗体形成外，还对骨髓造血干细胞定向分化起重要作用，引起炎症反应及较强的抗病毒活性；,作用方式的非特异性：由特异性抗原或非特异性因子诱生的细胞因子，均以非特异性方式起作用，既不与抗原发生反应，也不表现抗原特异性。,2,靶细胞的多样性：细胞因子作用的靶细胞多种多样，包括单核,-,巨噬细胞、淋巴细胞、多型核白细胞、胸腺细胞、,NK,细胞、骨髓细胞和成纤维细胞等。该特征是构成机体复杂的细胞,细胞调节网络的基础。,3,多源性： 表现为一种细胞因子可由多种不同来源的细胞产生，如可产生,IL-1,的细胞有,B,细胞和,NK,细胞等免疫活性细胞及巨噬细胞、树突状细胞、郎罕氏细胞和星形细胞等抗原提呈细胞；,一种免疫细胞可以产生多种细胞因子。,T,细胞可产生,IFN-,、,TNF,及,IL,等细胞因子。,4,高效性：细胞因子的作用方式与内分泌激素类似，有内分泌（,endocrine,）、旁分泌（,paracrine,）及自分泌（,autocrine,）等几种形式，因此又有免疫激素（,immune hormone,）之称。细胞因子在机体内的产量虽很低，但都表现极高的生物学活性，,10,-1,10,-15,M,即可显示明显的生物学活性。,5,快速反应性：即对激发因素的迅速反应。细胞因子是一种分泌型蛋白质，当免疫细胞受到刺激后，迅速在粗面内质网内合成，转移到高尔基体内糖基化，然后通过分泌颗粒不断排出细胞外。它在细胞内极少存储，一旦刺激终结，即停止合成，并迅速降解。,（三）细胞因子的应用,1作为免疫佐剂，提高疫苗的免疫效果：,有些疫苗特别是死苗和亚单位苗免疫效果往往不理想，而多种细胞因子可以调节免疫应答，是有效的免疫增强剂，可提高机体免疫应答能力，明显提高疫苗的免疫效果。但细胞因子佐剂活性一般不如常规佐剂。,2,作为免疫治疗剂，预防和治疗某些病原感染,用细胞因子处理未感染动物，可以增强动物的免疫功能，起到免疫治疗的作用。,如TNF、IL-1、IL-6和IL-8等细胞因子均参与机体的炎症反应过程；许多细胞因子对外来致病微生物及对肿瘤细胞生长都有抑制作用，在临床上具有潜在的应用价值。,3,通过基因重组，构建新型基因工程疫苗：,将细胞因子基因插入一些基因缺失疫苗或活载体内，并使之表达，可以克服一些疫苗在特定状态下的安全问题，从而获得理想的疫苗。如把小鼠或人,IL-2,的,cDNA,与含禽流感血凝素（,HA,）基因的痘病毒重组，获得可以表达,IL-2,的重组痘病毒。裸鼠免疫试验结果显示，,IL-2,的插入并不影响,HA,的表达水平及免疫原性，并且可以防止禽流感病毒对裸鼠的致死，说明插入细胞因子可以大大提高活病毒载体的安全性。,