基因诊断与基因治疗

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因诊断与基因治疗,主要内容,基因诊断（,4-18,）,基因治疗（,4-25,）,2,2013,年，,H7N9,禽流感来袭，快速而准确地对疑似患者作出诊断，能有效的增大患者的生机。,通过什么方法作出快速诊断？如何来进行治疗？,3,基因诊断能够快速检测出疑似患者的送检样品中是否含有,H7N9,病毒的特定基因。,4,48,小时内使用最有效,5,利用分子生物学方法，,直接检测基因结构及其表达水平是否异常,，从而对疾病作出诊断,为治疗提供依据。,特点：,针对性强，特异性高,实用性强，诊断范围广,预见性，适应性,基因诊断,6,基因诊断常用技术方法,（一）核酸分子杂交技术,（二）聚合酶链反应,(PCR),（三）基因测序,（四）基因芯片,7,核酸分子杂交技术原理,8,Southern,印迹杂交法（,Southern blotting,）,Northern,印迹杂交法（,Northern blotting,）,斑点杂交或狭缝杂交法（,Spot/ Slot blot hybridization,）,菌落杂交（,colony hybridization,）,夹心杂交法（,sandwich hybridization,）,原位杂交（,hybridization in situ,）,常用固相核酸杂交方法,9,(1) Southern,印迹杂交法,限制性内切酶酶切,检测杂交信号,提取,DNA,Southern,法可用于检测特异的,DNA,序列,片段,进行基因定位、分子量测定等。,10,（,2,）,Northern,印迹杂交法,（其基本过程类似于上述,Southern,法）,提取,RNA,样本,RNA,变性琼脂糖凝胶电泳分离转移至膜探针（标记,DNA,或,RNA,）与之杂交显影或显色检测信号。,Northern,法可用于检测组织细胞中总,RNA,或,mRNA,11,（,6,）原位杂交,将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而,检测特异的,DNA,或,RNA,序列。,细胞原位杂交、组织切片原位杂交,DNA-DNA,、,RNA-DNA,、,RNA-RNA,优点：,不需提取核酸,，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。,12,（二）聚合酶链反应（,polymerase chain reaction PCR,）,Kary Mullis,research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus,co-winner of,1993 Nobel Prize,13,PCR,产物以指数形式增加，即,Y = 2,n,n,为循环数,14,（三）基因测序技术,他们给,DNA,的测序带来了一场革命，分享了,1980,年的诺贝尔化学奖。后来,Sanger,法发展为自动化测序法，并为人类基因组测序做出了卓越贡献。,Fred Sanger,发明的末端合成终止法,(sanger,法,),Walter Gilbert,发明的化学裂解法,Maxam-Gillbert,法,15,（四）基因芯片技术,快速、高通量、平行化、自动化,16,基因诊断方法,经典基因诊断,.,限制性内切酶法,.RFLP,分析法,.,寡核苷酸分析法,优点,缺点,特异基因诊断,未知基因诊断,直接，过程简单,过程繁杂,准确性低，过程繁,条件严格,基因诊断进展,.,PCR方法,.PCR-,序列分析法,.DNA,芯片技术,简单、经济、敏感,操作直接、准确,集成度高、快速、并行,假阳性高,价格高,尚无成熟产品问世,17,四,.,基因诊断的临床应用,遗传疾病,肿瘤,感染性疾病，传染性流行病,判断个体疾病易感性,器官移植组织配型,法医学中个体识别、亲子鉴定,18,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,Mst,酶切位点,(CCTNAGG),5,3,正常基因,5,3,突变基因,1.15kb,1.35kb,0.2kb,正常,珠蛋白基因：,5,CCTG,A,GG,3,镰刀型贫血：,5,CCTG,T,GG,3,+,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带着,患者,19,实时荧光定量,PCR,技术,(Real time Quantitative PCR),实时监测 荧光 起始模板,Real Time vs. Traditional PCR,PCR,20,21,PCR,分四个阶段,Theoretical,Real Life,Log Target DNA,22,Ct,value,Baseline,Threshold,23,24,理想的,PCR,反应,X,n,X,0,2,n,*,X,n,：第,n,次循环后扩增产物数量,X,0,：起始模板数量,n,：扩增循环数,荧光定量,PCR,原理,Ct,值定量的数学原理,非理想的,PCR,反应,X,n,X,0,（,1,En,）,n,*,X,n,：第,n,次循环后扩增产物数量,X,0,：起始模板数量,n,：扩增循环数,En,：扩增效率,荧光定量,PCR,原理,Ct,值定量的数学原理,在扩增产物达到荧光阈值时,X,Ct,X,0,（,1,En,）,Ct,M,（,1,）,*,X,Ct,：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为,M,方程式（,1,）两边同取对数得：,Log,2,M,Log,2,X,0,*,（,1,En,）,Ct,（,2,）,整理方程式（,2,）：,Log,2,X,0,Log,2,M,Ct,Log,2,（,1,En,）,荧光定量,PCR,原理,Ct,值定量的数学原理,28,SYBR Green,I,TaqMan,Probe,Molecular Beacon,TaqMan,SYBR Green,I,G,T,T,T,G,G,C,C,C,C,C,C,C,A,A,A,G,G,G,A,C,T,T,G,A,T,A,G,C,A,T,C,G,T,A,A,30,31,Dissociation curve,32,TaqMan,33,Probes and Primers,(Primer Express 3.0 software),Primer Length: 15-30bp,PCR Product: 100-200bp,G+C%: 40,60,Tm of primers: 55-60 ,Tm of probes: 65 (10 ),No G at 5,34,探针中,GC,含量的差异对定量,PCR,反应效率的影响,36,Methods of Quantification,37,Absolute Quantification,38,39,Relative Quantification,40,41,斜率与扩增效率,42,43,0,1,2,3,4,5,6,Sample1,Sample2,Sample3,Sample4,实验组,实验值,-Actin,GAPDH,-2-microglobulin,HPRT,44,45,The End,谢谢您的聆听！,期待您的指正！,