酶的结构纯化及活性(十一)

,四、酶的活性部位与必需基团,必需基团,(essential group),酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的化学基团。,酶分子中直接和底物结合，并和酶的催化作用直接有关的部位,酶的活性中心(active center)或,活性部位,(active site),1.在酶活性部位上的基团又可以分为两类：, 参与和底物结合的基团称为,结合基团，决定酶的专一性, 直接参与催化反应的基团称为,催化基团，决定酶的催化能力以及酶促反应的性质,2. 构成酶活性中心的常见基团：,His的咪唑基、Ser的OH、Cys的SH、Glu的,-COOH。,3. 酶的活性部位,酶的活性部位=结合部位+催化部位,结合部位决定酶的专一性,催化部位决定酶的催化能力和反应性质,每种酶至少含有一个结合部位，每个结合部位至少结合一种底物。,4. 活性中心外的必需基团（调控部位）,调控部位,:,酶分子中存在着一些可以与其他分子结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。,底 物,活性中心以外的必需基团,结合基团,催化基团,活性中心,五、酶活性部位的特点,所占比例很小。通常占,1%2%,的体积比,活性部位具有三维立体结构。,活性部位的三维结构在形状、大小等方面与底物互补,3.,活性部位含有特定的催化基团和结合基团,催化基团包括氨基酸侧链的化学功能团和辅因子的化学功能团。,4.,活性部位具有柔性,活性部位具有柔性，易在底物诱导下发生构象变化，与底物形成互补结构,5. 活性部位通常是一个裂缝,裂缝为底物提供疏水的微环境，利于反应进行,活性部位的形成要求酶必需有完整的空间构象,第三节 酶作用的专一性,一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种选择性称为酶的特异性或专一性,。,酶的特异性(specificity),特异性,立体异构特异性,结构特异性,相对特异性,绝对特异性,键特异性,基团特异性,一、 结构特异性,1. 键特异性,对底物分子中其所作用的,键,要求严格，而不管键两端所连基团的性质,2. 基团特异性,要求底物具有特定的,化学键,，而且对键的一端所连,基团,也有一定要求,3. 绝对特异性,酶对作用的底物要求相当严格，甚至,只能催化一种底物进行化学反应,绝对特异性,酶只作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物,。,如：,相对特异性,酶作用于一类化合物或一种化学键（,键特异性,）。,酶仅作用于立体异构体中的一种。,二、 立体结构特异性,立体异构的生理意义：,维持新陈代谢的有序性和稳定性,举例：利用酶促反应可生产特定构型的单一立体异构体药物。,六、酶原和酶原的激活,酶原：,没有活性的酶的前体。,酶原的激活：,酶原在一定条件下经适当的物质作用可转变成有活性的酶，称为酶原的激活。,本质：,酶原的激活实质上是酶活性部位形成或暴露的过程（,不可逆,）。,酶原激活的机理:,酶原,分子构象发生改变,形成或暴露出酶的活性中心,一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽,在特定条件下,赖,缬,天,天,天,天,甘,异,赖,缬,天,天,天,天,缬,组,丝,S,S,S,S,46,183,甘,异,缬,组,丝,S,S,S,S,肠激酶,胰蛋白酶原,活性中心,胰蛋白酶原的激活过程,胰蛋白酶,胰蛋白酶原,胰蛋白酶,六肽,+,弹性蛋白酶原,弹性蛋白酶 + 碎片,胰凝乳蛋白酶原,-胰凝乳蛋白酶 +二肽,羧基肽酶原A,羧基肽酶A + 碎片,肠激酶,自身催化,肠激酶启动的酶原激活,酶原激活的意义,参与消化生理过程，避免细胞自身消化,各种消化酶在消化腺中是酶原，进入消化道后被激活为活性的酶。举例：胰蛋白酶,消化酶以酶原形式存在，可保护消化腺不被破坏,参与凝血因子的激活过程,凝血因子在机体受伤时被激活为蛋白酶，参与凝血。各种凝血因子间存在激活作用，最终使凝血酶原激活。,参与代谢调控和信号转导,六、同工酶（isoenzyme）,（一）定义：,催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。,（二）特点：,1、都是寡聚酶,2、不同的亚基组成,3、不同亚基的活性中心非常相似,4、组织分布部位不同,5、所催化的反应有侧重点,如：,生理及临床意义,在代谢调节上起着重要的作用；,用于解释发育过程中特有的代谢特征；,同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断；,可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。,心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化,1,酶活性,心肌梗死酶谱,正常酶谱,肝病酶谱,2,3,4,5,第四节 酶的分离纯化与活力测定,一.酶的分离纯化,1、 基本原则：,提取过程中避免酶变性而失去活性,防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等；,要求在低温下操作，加入的化学试剂,不使酶变性，操作中加入缓冲溶液。,选材：,材料中酶含量要高且易于处理，然后对材料破碎，离心并收集目标酶。,粗制分离：,用盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂分级分离法等对目标酶进行粗分离,精制分离：,用柱层析法、梯度离心等对粗酶进一步纯化,酶制剂的脱盐、浓缩、干燥和保存,用透析法、超滤法、凝胶过滤法来脱盐；,用沉淀法、吸收法、超滤法等除去水分，称浓缩；,用冷冻真空干燥法对酶做处理，便于运输；酶需低温保存,2、基本操作程序,3、酶分离纯化时的注意事项,纯化时保持低温，温度越低越好,使用温和的操作条件,使用一些保护试剂，如金属螯合剂等,尽量缩短纯化时间,二、酶活力的测定,酶活力,：,又称为酶活性，通常以在一定条件下酶所催化的,化学反应速度,来表示。,基本原理:,最优化条件下，当底物足够，酶促反应的初速度与酶的浓度成正比，化学反应速度可代表酶活性分子浓度。,1、酶活力测定,酶活力测定就是测定一定量的酶，在单位时间内产物(P)的生成量或底物（S）的消耗量。,即测定时确定三种量：,加入一定量的酶；一定时间间隔；物质的增减量。,酶活测定时一般测定产物的增加量,在反应过程中产物是从无到有，变化量明显，极利于测定，所以大都测定产物的生成量。,具体物质量的测定，常用的方法有：,光谱分析法,：酶将产物转变为（直接或间接）一个可用,分光光度法或荧光光度法,测出的化合物。,化学法,：利用化学反应使产物变成一个可用某种物理方法测出的化合物，然后再反过来算出酶的活性。,放射性化学法,：用同位素标记的底物，经酶作用后生成含放射性的产物，在一定时间内，生成的放射性产物量与酶活性成正比。,测酶活所用的反应条件应该是,最适条件,，所谓,最适条件,包括最适温度、最适pH、足够大的底物浓度、适宜的离子强度、适当稀释的酶液及严格的反应时间，抑制剂不可有，辅助因子不可缺。,3、酶反应条件优化,1）酶活力单位的标准化规定,在,最佳条件,或某一固定条件下，每分钟催化1,mol底物转化为,产物所需要的酶量为一个酶活力单位。,4.,酶活力的表示方法及计算,2）如果底物（S）有一个以上可被作用的化学键，则一个酶单位表示1分钟使1mol有关基团转化的酶量。如果是两个相同的分子参加反应，则每分钟催化2mol底物转化的酶量称为一个酶单位。,3）酶的比活力,酶的比活力是每单位（一般是,mg,）蛋白质中的酶活力单位数（如：酶单位,/mg,蛋白）。,对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质越少），,所以比活力是评价酶纯度高低的一个指标。,第五节 酶工程,酶工程,是研究酶的生产和应用的一门技术性学科，是将酶学原理、化学工程技术及基因重组技术有机结合在一起而形成的新型应用技术。,根据研究内容不同，酶工程分为两类：,化学酶工程,生物酶工程,化学酶工程,化学酶工程主要涉及酶的制备、,酶的化学修饰、酶的固定化,等。,(1) 自然酶,是指由生物材料中分离出来的酶。,(2) 化学修饰酶,又称“生物分子工程” ，是通过对酶分子实行“手术”以达到改构和改性的目的。,(3) 固定化酶,将酶分子通过吸附、交联、包埋及共价键结合束缚于某种特定支持物上而发挥酶的作用。可反复使用 。,(4) 人工合成酶,模拟酶的催化功能，用化学方法合成具有专一性的催化剂。,酶的化学修饰：,用人工方法将酶分子与一些小分子化学基团或具有生物相容性的大分子进行共价修饰，从而改变酶的性质，创造出天然酶没有的优良性能。,将酶吸附在载体表面,（,载体结合法,）,将酶相互连接起来,（交联法),将酶包埋在细微网格里,(包埋法）,酶的固定化：,通过吸附、共价结合、包埋及交联等方式束缚于某种支持物上发挥酶的作用。,1）载体结合法,载体结合法是指将酶固定到非水溶性载体上的方法。,物理吸附法、离子结合法、共价结合法。,2）交联法：,通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法。交联法使用的交联剂是戊二醛等水溶性化合物。,3）包埋法,：将酶包裹在多孔的载体中。,生物酶工程,主要任务是：,(1) 采用基因重组技术，利用微生物、动植物细胞作为生物反应器大量生产酶。,(2) 通过基因工程技术，使酶基因发生定位突变，产生遗传性修饰酶(突变酶)。,(3) 设计新酶基因，合成自然界不曾有的新酶。,是酶学与基因重组技术相结合的产物,改造酶分子的方法：,1. 通过化学修饰的方式来改变酶的结构；,2. 通过遗传修饰的方式，利用分子生物学技术改造酶分子的基因，进一步改造酶的结构和功能。,第六节 核酶、抗体酶,1、核酶：,具有催化能力的核糖核酸。,1982,年美国,T.,Cech,等人发现四膜虫的,rRNA,前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，即,RNA,有催化活性，并将这一类酶命名为核酶。,1983,年，,Altman,等发现核糖核酸酶,RNAse,P,中的,RNA,部分,(MIRNA,），单独存在时以及其转录产物均具有催化功能。,1985,年，,Cech,等发现,L19RNA,也具有催化功能。,核酶发现的意义,1）核酶证明了酶不都是蛋白质,2）,核酶的发现表明，RNA既能够携带遗传信息，又具有生物催化功能。由此推测RNA可能早于DNA和蛋白质，是生物进化时首先出现的大分子。,3）对核酶的研究，可帮助设计生物体内不存在的核酶，去催化特定反应。,2、抗体酶：具有催化能力的免疫球蛋白，又称催化性抗体,1）诱导法生产抗体酶的原理：,以底物过渡态类似物做半抗原诱导出抗体，该抗体的抗原结合部位与底物过渡态类似物有互补构象，可与底物结合促使底物进入过渡态，降低反应活化能，产生催化作用。,2）抗体酶的应用,生产单一构象的药物分子,可用于癌症的治疗,