蛋白组学定量蛋白质组学

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蛋白质组学,1,第四章,定量蛋白质组学,Quantitative proteomics,定量蛋白质组学，就是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体系中所有的蛋白质进行精确定量和鉴定的一门学科。,2,蛋白质组学的研究目的是以大规模的尺度研究细胞蛋白质的功能。,依靠,2-DE,和质谱技术，蛋白质组的研究策略和方法在细胞蛋白质的鉴定上已经比较成熟。,但是仅仅进行鉴定并不能提供用以阐明蛋白质的功能的全部信息，监控蛋白质的表达水平对阐明细胞体内存在的各种生物进程是非常重要的。因此，定量蛋白质组学作为蛋白质组学研究的重要一部分被提出来。,3,常用研究方法,以质谱技术为基础的化学标记定量方法,荧光差示双向凝胶电泳技术（,F2DDIGE）,4,化学标记定量,对具有相同离子化能力的蛋白质或多肽，通过比较质谱峰的强弱，可以得到其相对量的数值。,用一种质量标签来标记一种状态下的蛋白质，与另一种状态下没有标记的蛋白质混合起来，进行质谱分析，然后比较某个蛋白质没有标记的峰和标记后峰的强弱，就可知道该蛋白质在这种状态下表达量的变化。,常用的是在样品中加入包含稳定的重质同位素(,2,H、,13,C、,15,N、,18,O、,35,S),试剂, 与被分析物结合而被标记，通过质谱检测以确定其蛋白质的表达水平。,5,标记方法,体内标记,15,N,体内,代谢标记,稳定同位素标记的,必需氨基酸,体内标记,(SILAC,法,),体外标记,-NH,2,氨基标记,COOH,羧基标记,-SH,巯基标记,ICAT,策略,6,（一）体内代谢标记方法,培养方法：将两种细胞样品分别置于正常培养介质（,14,N,）和富含某重质同位素（,15,N,）的相同培养基中培养。,蛋白质提取：培养一定时期后，将两者混合，然后破细胞，提取相关部位感兴趣的蛋白质，进行消化酶解。,鉴定：通过选择性亲和分离、色谱分离等过程，最后进行质谱分析。每一对分析肽段与内标肽段在得到的,质谱图,中表现为一对峰，峰的间距等于肽段中所含的氮原子的个数。,7,酿酒酵母,G1,细胞周期蛋白,Cln2,的影响：,cln2,:,14,N,CLN2,:,15,N,A:,翻译延伸因子,1a,cln2,:,CLN2,1,：,0.93,B,：,磷酸丙糖异构酶（,Tpi1,）,代谢标记典型质谱图,8,体内代谢标记法具有较好的稳定性和重复性,9,15,N,体内代谢标记也可以定量位点特异的化学修饰,磷酸化修饰定量：,X,：未被磷酸化的肽段,Xp,：被磷酸化的肽段,X,被磷酸化成,Xp,后分子量会增大，在,MS,图谱上峰会迁移,10,特点,代谢标记方法比较准确和稳定,可以检测蛋白质在,pmol,浓度内的20的量的变化。,不能直接用于组织样品的分析。,同位素试剂需要量较大，成本高。,相同肽段的不同同位素标记形式之间的质量变化依赖于氮原子数目，因此对未知的蛋白质难以进行定量。,11,（二）,稳定同位素,标记的,必需氨基酸体内,标记,(SILAC,法,),高等动物细胞的生长中需要一些必需氨基酸的摄入，如赖氨酸,(Lys),、亮氨酸,(Leu),、苯丙氨酸,(Phe),等，这些氨基酸细胞自身无法合成，需要从外界摄入补充。,在培养细胞时，可以在培养介质中特异的加入用稳定同位素标记的某一种必需氨基酸，在经过适当的培养时间后，细胞中合成的含有这类氨基酸的蛋白质几乎都掺入了标记的氨基酸 。,收获不同同位素标记的不同生长状态下的细胞，混合裂解，再做质谱，就可以从质谱图上得到蛋白质差异表达量的信息。,这种蛋白质定量策略称为,SILAC (Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture,，细胞培养物中含有稳定同位素的氨基酸标记,),12,SILAC,法,:,鼠肌肉细胞分化过程中蛋白表达量变化,Leu-d0 Leu-d3,(L-leucine-5,5,5-D3),Leu,被标记：丰度最高氨基酸,13,Leu-d3,可被细胞吸收肽段：,VAPEEHPV,LL,TEAP,L,NPK,，带,3,个电荷,14,3-,磷酸,-,甘油醛,-,脱氢酶表达变化,15,用,Lys,来标记明显好于其他的必需氨基酸，,因为当用胰蛋白酶,(Trypsin),酶切时，,保证了含有,Lys,残基的每个肽段都只含有一个标记物,避免了未知肽段用,15,N,标记所带来的质量变化不清的类似问题,有利于蛋白质做,MS/MS,鉴定时质谱图的解析,16,体内标记和体外标记比较,总的来说，体内标记相对于体外标记方法来说具有一些自身的优势,省去了标记化学反应和分离纯化等步骤，因而减少了样品的损失,有利于低丰度蛋白质的高灵敏度检测,体内标记也存在一些缺点,培养细胞在富含稳定同位素的介质中生长，这些介质可能会影响细胞的繁殖和其他生物进程，由此改变蛋白质的表达水平,这种方法受到同位素材料成本的限制，不可能整个动物体进行标记,对于未知序列肽段，大多数的体内标记都无法确定标记物与肽段之间量的关系，从而使得我们难以确认同一肽段在质谱图上成对出现的不同同位素标记形式,17,体外标记常用方法,-NH,2,氨基标记,COOH,羧基标记,-SH,巯基标记,ICAT,策略,18,NH,2,标记（,d0/d3,、,d0/d4,法）,多肽的,N,末端和,Lys,残基侧链上是,-NH,2,基团，容易跟含有,酰氧基,的小分子如琥珀酸酐、,N-,乙酰氧琥珀酰亚胺等发生,酰基化,反应，从而对肽段进行标记。,采用一种正常的酰基化试剂与分别含,3个（,d0/d3,）、4个氘原子（,d0/d4,）,的氘代酰基化试剂标记酶解后的多肽体系。该类试剂可与肽的,N-,端氨基,发生稳定的酰基化反应，还可与肽中,赖氨酸的,-,氨基,反应。,当某肽段中不含赖氨酸时，分析物与内标物的质谱峰对分别相差3和4个质量单位，被分析肽段中每增加一个赖氨酸残基，该质谱峰对的差距就分别增加3和4个质量单位。,19,d0/d3,标记蛋白质,N,末端原理,N-,乙酰氧基琥珀酰亚胺,(N-Acetoxysuccinimide,),三氘代,N-,乙酰氧基琥珀酰亚胺,(N-acetoxy-D3succinimide ),20,MALDI-TOF /MS,分析,N,末端乙酰化肽段,1195.6126,1198.6418,21,MALDI -TOF/MS,分析,N,末端和,Arg,的,NH,2,乙酰化肽段,1574.7610,1580.7624,22,E.coli,半乳糖苷酶蛋白水平,半乳糖苷酶蛋白表达量可被诱导表达提高到,2.5,倍,诱导表达：,1,H,3,标记,未诱导表达：,2,H,3,标记,23,d0/d4,标记蛋白质,N,末端原理,H4-Nic-NHS1-(H4-,烟酰氧基,),琥珀酰亚胺,四氘代,H4-Nic-NHS1-(H4-,烟酰氧基,),琥珀酰亚胺,24,MALDI-TOF mass spectrum of a peptide labeled with succinic anhydride and deuterated succinic anhydride,25,d0/d4,修饰,N,末端,NH,2,或,-NH,2,依赖反应条件,26,27,28,d0/d4,标记用于分析蛋白质表达相对量,29,E.coli,在完全培养基和条件限制培养基中的蛋白表达比较,30,d0/d4,标记,37,点，进行,MS,分析,37,点,：,两个蛋白,一个蛋白量上没有变化（*）,一个蛋白在条件限制培养基中表达增加，,1:3,31,Lys,上,-NH,2,特异标记方法：,MCAT,O-,甲基异脲,(,O-,methylisourea),可以选择性地胍基化,Lys,残基上的,-NH,2,。,不标记,N,末端的,NH,2,和其它残基侧链。,“,质量标记的丰度标签,”,(Mass-Coded Abundance Tagging,，,MCAT),的标记策略。,每标记上一个胍基，片段分子量增加,42Da,。,32,MCAT,策略流程：定性,Lys,只在,Trypsin,酶切后的末端，所以产生的,b,离子都没有被修饰；所有的,y,离子带,Lys，,因此被修饰。,在,MS/MS,图谱上，所有的,b,离子是单一条带出现，所有的,y,离子是成对出现，丰度比例一样，且相差同样的,m/z,。,容易区分,b,离子和,y,离子，容易读出氨基酸序列。,33,MCAT,策略流程：定量,将来源不同样品的裂解物进行标记或不标记，然后等量混合，经,LC,分离，在,MS,图谱上就可分析不同蛋白量的变化,34,酵母细胞提取物的离子层析和,LC/MS,图谱：定性分析,肽段胍基化后分子量增大，在层析图上较晚出现。,35,肽段的定量分析,肽段被胍基后，分子量增加,42Da,，但是带,2,个电荷，,m/z,相差,21,个单位,通过离子交换层析图谱上峰的面积，可以计算两种肽段的相对量,0.88 : 1,36,MCAT,优点,O-,甲基异脲,(,O-,methylisourea),对,Lys,残基,-NH,2,的胍基化程度可以进行量上的控制,增加的质量（每个胍基,42 Da,）可以很容易在,MS,上检测到,-NH,2,的胍基化修饰并不影响肽,段,的离子化和带电荷程度,37,COOH,羧基标记,通过对羧基酯化进行标记,用,H,和,D,标记的甲醇酯化标记，来定量研究蛋白质表达量的差异,38,羧基酯化标记进行蛋白定量研究,比例,2 : 1,39,缺点：,特异性不是很好，在,C,末端和,Asp,和,Glu,残基上都有标记，且效率不均,采用的标记条件容易引起天冬酰胺,(Asn),和谷氨酰胺,(Gln),的去酰胺,40,COOH,羧基标记,在,H,2,18,O,的溶液中进行蛋白酶切，从而特异性的只在,C,末端引入稳定的同位素标记,这类蛋白水解酶只在肽段的,-COOH,端引入一个,18,O,41,这类蛋白水解酶只在肽段的,-COOH,端引入二个,18,O,42,标记后的肽段在质谱上的分离,43,18,O,进行蛋白质组的标记和定量,44,-SH,在标记反应中的作用,Cys,残基上的,-SH,基团更具有标记反应的特异性 ，如烷基化试剂如碘乙酸等能专一的对,Cys,的巯基进行烷基化 。如果将稳定同位素引入这些烷基化试剂，那么就可以通过比较质谱图谱上成对出现的质谱峰信号的强度进行相对定量了。,Cys,是一种特殊的氨基酸，在蛋白质酶切产生的多肽片段不一定含有,Cys,残基。,E.coli,和酵母细胞中含有,Cys,残基的蛋白质分别占到蛋白质总量的,85.7%,和,91.6%,，而在,trypsin,酶切产生的肽段中，含有,Cys,残基的多肽分离仅占,9.4%,和,9.3%,。,如果能将这些烷基化标记的肽段给分离出来鉴定和定量，既能检测到足够多的蛋白质，又大大减少了工作量，更适宜大规模操作。,45,d0/d8,法（,ICAT,方法）,同位素标记的亲和标签方法(,Isotope Code Affinity Tag),ICAT,试剂是一种人工合成的有机分子，包括三个部分：,反应基团,，可特异的与蛋白质侧链上的,Cys,残基的巯基,(-SH),进行反应，使试剂共价结合在蛋白质侧链上。,同位素标记的,接头,，含有稳定同位素,(H,和,D),的标记。,亲和标记的,生物素,，用于分离标记的蛋白质或多肽。,46,reactive group,biotin tag,linker (heavy or light),S,HN,NH,O,N,H,O,O,O,H,H,H,H,N,H,I,O,H,H,H,H,Light Reagent (D0),Heavy Reagent (D8),Isotope Coded Affinity Tag Reagents (ICAT),reactive group,biotin tag,linker (heavy or light),S,HN,NH,O,N,H,O,O,O,D,D,D,D,N,H,I,O,D,D,D,D,47,X =,Hydrogen (light),or,Deuterium (heavy),S,H,cys,+,Protein (reduced),ICAT Reagent (D0 or D8),ICAT labeled Protein,1),Label Proteins with D0/D8 ICAT Reagent, Digest,S,HN,NH,O,N,H,O,O,O,X,X,X,X,N,H,I,O,X,X,X,X,S,cys,S,HN,NH,O,N,H,O,O,O,X,X,X,X,N,H,O,X,X,X,X,Trypsin,(or other enzyme),48,ICAT labeled peptide,+ other peptides,+,Wash off other peptides then Elute from Avidin,Avidin,Elute,Wash,ICAT labeled peptide,2),Purify ICAT Labeled Peptides,S,cys,S,HN,NH,O,N,H,O,O,O,X,X,X,X,N,H,O,X,X,X,X,S,cys,S,HN,NH,O,N,H,O,O,O,X,X,X,X,N,H,O,X,X,X,X,S,cys,S,HN,NH,O,N,H,O,O,O,X,X,X,X,N,H,O,X,X,X,X,49,ICAT labeled peptide,Quantify,MW,Intensity,MS,MS/MS,Identify,Sequence,3),Analyze ICAT Labeled Peptides,8,Da,T S V Q,S,cys,S,HN,NH,O,N,H,O,O,O,X,X,X,X,N,H,O,X,X,X,X,50,Mix &,Denature,MiniPrep,Cell,Molecular,Weight,Separation,Into SDS,Buffer,Fraction,proteolyze,Affinity,Purification,Flow-through,ICAT Reagent,-Cys Peptides,Finger Printing: Protein ID,Quantitation: Protein Expression,1366.0,1465.8,1565.6,1665.4,1765.2,0,50,100,1566.0,1576.8,1587.6,0,50,100,Finger Printing: Protein ID,ICAT-SDS Prep Gel Method,51,ICAT,方法操作步骤,52,53,54,ICAT,策略优点,应用,ICAT,策略对蛋白质进行鉴定和定量,若一种蛋白质酶切产生至少有一个,Cys,残基的肽段的话，就可以对其鉴别和定量。含有,Cys,残基的肽段越多，结果对照得出的结论越准确。,鉴定的肽段中肯定都含有至少一个,Cys,，因此在进行数据库搜索时就增加了一个有效的约束条件。,肽段根据标记情况有选择性的得到了富集，从而减少了下游质谱分析的复杂程度。例如,Gygi,等用,ICAT,处理酵母蛋白混合物时，从,344,855,个肽段中富集了,30,619,个标记肽段，大大减少了后期的工作量。,分离出来的标记多肽可直接与后面的,RP-LC-MS,分析系统在线偶联操作。,55,ICAT,方法的缺点,从相互比较的样品处理到最后的质谱定量分析经过的步骤较多；,ICAT,试剂修饰的得率等微小差异都可能干扰两种差异表达蛋白质的精确定量；,只能分析含有,Cys,残基的多肽，对于那些在功能上有重要作用的但不含,Cys,残基的蛋白质将会被遗漏。,56,二、荧光差示双向凝胶电泳技术,(F-2D-DIGE),Fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis,57,蛋白质染色要求,对一个蛋白质混合物，首先用,2D,进行分离，然后对蛋白质点进行染色，再通过比较单个蛋白质染色强度，对其进行分析。,理想的染色方法满足：,良好的线性范围，染色强度和蛋白质浓度成正比,好的通用性，不同蛋白质具有相同的染色能力,高的灵敏度，检测出低拷贝蛋白质,不影响后续鉴定过程,考马斯亮蓝染色：灵敏度低,银染：影响后续鉴定，线性范围窄,58,F2DDIGE,技术是在传统双向凝胶电泳基础上发展起来的定量分析凝胶上蛋白质点的新方法。,运用,不同的荧光染料,分别标记,不同的蛋白质,，然后将它们等量混合，在,单一的,2D,胶,上进行分离和鉴定，按照它们所发出的荧光强度差异，来比较蛋白质量的变化。,其优点是可以在,同一块凝胶上,比较两种不同来源或不同处理的蛋白质组表达谱，能比较,精确,地在,较宽的动态范围,内对研究者感兴趣的蛋白质,定量,，因此成为一种有较好应用前景的定量蛋白质组学研究方法。,59,原理,将待比较的两种样品提取的总蛋白质分别与两种不同的荧光标记试剂（,Cy3,或,Cy2，Cy5）,进行共价标记；,然后将不同荧光染料标记的两种待比较的蛋白质样品等量混合，上样进行双向电泳；,2,D,凝胶在成像仪上用两种不同波长激发，并将两种样品的荧光图谱显示成像，用2,D,软件进行定量分析；,将定量显示有明显差异的蛋白质点切下后进行鉴定分析，从而确定差异表达的蛋白质。,60,Introduction of 2D-DIGE,CyDye,TM,DIGE Fluorescence minimal dyes,3 dyes,Label -amino group of lysine,Carry +1 charge,3% of lysines are labeled,MW matched (450Da),The same protein is labeled to the same extent with different dyes.,Detection Limit = 125 pg protein,Dynamic range 10,4,Cy2,Cy3,Cy5,61,Flow chart of DIGE analysis of procured normal cells and cancer cells from the same tumor sample,.,62,二维电泳荧光检测,Red Cy3,Green Cy5,63,DIGE gel images of normal and cancer cells.,A, Cy2 image of proteins from normal cells;,B, Cy5 image of proteins from tumor cells,64,染料,Cy2,Cy3,Cy5,分子量,Da,550.60,582.77,580.75,给蛋白质增加的质量,Da,434,466,464,荧光颜色,蓝,绿,红,最大吸收波长（,nm）,491,553,645,最大发射波长（,nm）,509,569,644,三种荧光标记试剂（花青染料）的物理性质,65,注意事项,蛋白质的被标记量控制在较低的标记率以便每个蛋白质分子只含有一个标记荧光分子。,加入内标增加分析的可靠性。,胶点的蛋白质离开荧光成像扫描仪后不可见，因此对胶点要进行定位。,66,