lab-2-3酵母胞外多糖的液体发酵、胞外多糖的提取与测定

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验二、三 斯达油脂酵母胞外多糖发酵、,提取及测定,一 教学要求,了解微生物液体培养法。,了解微生物胞外多糖的发酵及制备过程。,二 实验,原理,微生物多糖从其在细胞中的分布可分为细胞外多糖、细胞壁多糖和细胞内多糖。细胞外多糖（EPS）是指分布于细胞壁之外，以荚膜的形式附到细胞壁上或以粘液的形式分泌于胞外环境的同多糖或异多糖。EPS不但对微生物具有重要的生物学作用，而且在食品、化妆品、造纸、纺织印染和石油开采等工业上有广泛的用途。,1,许多微生物均能产生胞外多糖，但只有在合适的培养条件下才能大量产生积累该产物。本实验以斯达油脂酵母为生产菌种，选用高碳氮比的液体发酵培养基及高通气量等有利于菌株多糖合成的培养条件进行EPS发酵。,本实验多糖的定量测定采用苯酚硫酸法。多糖在浓硫酸作用下生成糠醛，糠醛能与酚类化合物作用生成有色物质，在490nm处有最大吸收值，且颜色深浅在一定范围内与糖含量呈线性关系，因此可采用分光光度法进行定量测定。,2,三 材料与器材,菌种：斯达油脂酵母（,Lipomyces starkeyi,）2. 1390.,试剂： （1）无机盐溶液：MgSO,4,.7H2O 0.4 % ，,MnSO,4,.H,2,O 0.2 %， FeSO,4,.7H,2,O 0.2 % ，NaCl 0.2 %,（2）种子培养基：蔗糖2%，酵母膏0.5%， pH6.5.,（3）摇瓶发酵培养基：蔗糖8%，蛋白胨0.3% ，K,2,HPO,4,0.35% ，KH,2,PO,4,0.35% ，无机盐溶液5mL/L pH6.5.,种子培养基和发酵培养基装量为250 mL 三角瓶30 mL，8层纱布塞于瓶口，并用牛皮纸包扎，培养基121 灭菌20 min。,3,四 操作步骤,1、胞外多糖发酵,斜面培养,将斯达油脂酵母2.1390菌株接在斜面培养基上,28培养48h 。,种子培养,在种子培养基中接入斜面菌种一环，用8层纱布展平包扎于瓶口，然后置28摇床（200 r/min）振荡培养36 h。 多糖发酵,在发酵培养基中接入种子液1.5ml，用8层纱布展平包扎于瓶口后，放置28摇床（200 r/min）振荡培养108 h 。,4,2、多糖的提取及测定 粗多糖的提取及测定样品液的制备,发酵液用蒸馏水稀释3倍，3500r/min离心15min除菌体。取上清液1ml，调pH至6.0，加95%乙醇3ml，氯化钾饱和液1滴，混匀。静置让多糖充分沉淀，然后在3500r/min离心10min，弃上清液。沉淀用75%乙醇洗至无还原糖反应，经洗涤后的沉淀即为胞外粗多糖。将其溶于水并稀释至适当浓度（样品液）。,5,甘露糖标准曲线的制作 取6支干净试管，分别加入100g /ml甘露糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，不足1ml管用蒸馏水补足至1ml，各管再加6%苯酚溶液1.0ml ，摇匀，再加入浓硫酸5.0ml,混匀静置10min后在2530水浴中放置20min，取出。用1cm 玻璃吸收池，以空白管溶液为参比，在波长490nm处依次测定各管溶液的光密度值（OD）。 样品测定,取样品液1.0ml，同制作标准曲线步骤操作。,6,四、注意事项,1、注意无菌操作,2、多糖测定时，注意控制好供测样品的稀释倍数。,五、思考题,1、为什么在高碳氮比的液体发酵培养基中及高通气量进行发酵有利于菌株多糖的合成？ 2、用苯酚硫酸法测定多糖有何优缺点？,7,