细胞化学染色

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,细胞化学染色,沧州医专医学技术系 侯振江,细胞化学染色,，是一种以,形态,为基础，结合运用,化学,或,生物化学,技术对血细胞内各种化学成分作,定位,、,定性,及,半定量,分析的方法。,用于研究,血细胞生理,、,病理,和化学结构；,临床上为某些血液病的诊断、鉴别诊断、疗效观察、预后监测和发病机制的探讨，提供重要依据。,血细胞化学染色的基本要求是在,原位,显示细胞成分和结构，反应产物应是,有色沉淀物,，具有一定的,稳定,性。,血细胞化学染色可显示,糖原,、,脂类,、,酶,、,蛋白质,等。,（一）,固定,固定有,物理法,与,化学法,，,物理法,为干燥和火焰固定，,化学法,最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。,血细胞化学染色流程,（二）,显示,1,、,偶氮偶联法,：利用人工合成的酶底物，在酶作用下，产生分解产物，再与重氮盐结合引起偶氮偶联，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的存在。,2,、,联苯胺法,：粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶作用于过氧化氢，释放新生态氧，使无色的联苯胺形成蓝色沉淀。,3,、,普鲁士蓝法,：细胞内、外铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。,4,、,雪夫反应,：过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇基形成乙醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀。,5,、,金属沉着法,其他尚有物理学方法，如脂溶性染料染色（显示脂质）、荧光显示、放射自显影以及体外活体染色亦常用于临床血液细胞学诊断。,（三）,细胞化学定量,粗略估量,，以染色反应的强弱，受色的深浅，人为地区别为阴性和各种程度的阳性。,百分法,，只能反映细胞阳性率，不能反映受色强弱。,积分法,，是常用的半定量法，将等级估量与百分率相结合它既反映了细胞阳性率的高低，又反映了细胞受色的强弱。,下面介绍几种常用的细胞化学染色方法,这些方法学在白血病的鉴别诊断上具有重要意义。,一、过氧化物酶染色（,POX,）,（一）,四甲基联苯胺法,【,原理,】,粒细胞,和,单核细胞,的胞浆内的髓,过氧化物酶,（,POX orMPO,）分解,过氧化氢,，释放,新生态氧,，使,无色,联苯胺氧化成,蓝色,联苯胺，后者进一步变成,棕色,化合物沉着于,细胞质,内。,【,试剂,】,1%TMB,亚硝基铁氰化钠饱和溶液,1%,过氧化氢溶液,稀过氧化氢溶液,瑞氏染色液,【,操作,】,1.,取,0.1%TMB,乙醇溶液,lml，,加亚硝基铁氰化钠饱和溶液,10ml，,溶液呈淡,棕黄色,。,2.,在新鲜干燥的血片上，加混合溶液,0.5ml,放置,lmin,后，再加稀过氧化氢溶液,0.7ml，,染色,6min 。,3.,瑞氏染液复染,15,20min 。,4.,油镜镜检。,【,结果,】,细胞质内有,蓝黑色颗粒,者为阳性。,（） 无颗粒沉着；,（,） 颗粒细小 ，分布稀疏；,（,+,） 颗粒较粗，局灶分布；,（,+,） 颗粒粗大，分布较密，占胞质,1/22/3,；,（,+,） 颗粒粗大，呈团块分布；,（,+,） 全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核。,【,临床意义,】,（,1,）,粒系,：,POX,主要分布在,粒细胞,和,单核细胞,内，随着粒细胞,成熟,的程度而逐渐增强，中性分叶核粒细胞为,强,阳性,。,嗜酸,性粒细胞阳性程度,最强,，其阳性颗粒比中性粒细胞粗大，有折光。,碱性,粒细胞为,阴性,。,（,2,）,单核细胞,：,原始单,核细胞为,阴性,反应，,幼稚单,核细胞和,成熟单,核细胞呈,弱阳性,反应，颗粒细小，弥散分布。,（,3,）,其他细胞,淋巴,细胞、,浆,细胞、,幼红,细胞、,组织,细 胞、,巨核,细胞均呈,阴性,反应。,（,4,）,血小板过氧化物酶,主要定位于,幼稚型,巨核细胞的核膜上，可作为原巨核细胞的一种标志物，有助于,FAB M7,的识别。,（,5,）,过氧化物酶染色,主要用于,鉴别急性白血病类型,，,急性髓细胞白血病多呈,阳性,反应，以,M3,和,M2,型反应最,强,，,MI,和,M5,型反应较,弱,，,故有助于区别,M3,和,M5,型。,急性淋巴细胞白血病,呈,POX,阴性,反应，故为,急性髓细胞,和,淋巴细胞白血病鉴别,的重要指标。,AML-M1,M1 - POX(+),二、苏丹黑,B,染色,【,原理,】,苏丹黑,B (sudan black B , SB ),是一种能,溶解于脂肪,中的,色素,染料，可使细胞内的,中性脂肪,、,磷脂,和,类固醇,着色，即使细胞内微细结构的脂类物质也能显示出来。,【,试剂,】,1. 10%,甲醛液。,2.,苏丹黑,B,乙醇溶液,【,操作,】,1,干燥血片或骨髓片在甲醛蒸气中固定。,2,自来水冲洗。,3,放人染色液中，,37,染色,3060min。,4,用,70%,乙醇脱色,12min，,水洗,lmin。.,5,瑞氏染液复染,2030min。,【,结果,】,脂类呈黑色或,棕黑色,颗粒，定位于细胞浆中,（,+,） 颗粒很小，细小、稀疏，或胞质局部面积的,1/4,有致密的颗粒。,（,+,）颗粒较少，或胞质面积的,1/2,出现黑色颗粒。,（,+,）颗粒较密，或胞质面积的,3/4,出现黑色颗粒。,（,+,） 颗粒极密，颗粒间,无间隙,。,【,临床意义,】,1.,粒细胞系,早幼粒,及以下阶段随着细胞成熟，,阳性颗粒逐渐增加,。,早期原粒,细胞一般为,阴性,，少数细小点状颗粒代表线粒体被染色,晚期原粒,细胞可出现,阳性颗粒,，其颗粒限于胞浆的某一区域。,2.,单核细胞系,阳性，,颗粒细小，分布弥散，形状不规则。,原单核,细胞,为阴性,。,3,红细胞系,、,淋巴细胞系,均呈,阴性,反应,4,尼曼一匹克细胞,和,戈谢细胞,均为,阳性,反应。,5,苏丹黑,B,和过氧化物酶染色临床意义相似，主要用于,急性白血病类型的鉴别,。,苏丹黑,B,染色较过氧化物酶染色更,敏感,，但特异性不如过氧化物酶染色（极少数急性淋巴细胞白血病可为阳性）。,M1-SBB(+),M2-SBB(+),三、过碘酸一雪夫（,PAS),染色,【,原理,】,胞浆内存在,糖原,或,多糖类,物质（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的,乙二醇基,（,CHOH-CHOH）,经过,碘酸,（,periodic acid）,氧化，转变为,二醛基,（,CHO-CHO），,与,雪夫,(Schiff ),试剂中的,无色品红,结合，形成,紫红色染料,而沉积于,胞浆,中。该反应称为过碘酸一雪夫,(PAS),阳性反应。,【,结果,】,（,1,）粒细胞系：,原粒,细胞多呈,阴性,反应，也可,弱阳性,。,自,早幼粒,细胞以后随着细胞的成熟程度，阳性反应,逐渐增强,。,嗜酸粒,细胞颗粒本身不着色，但颗粒间的,胞质,呈弥漫性,阳性,反应；,嗜碱粒,细胞为,阳性,反应，颗粒紫红色，大小不一。,中性粒细胞糖原含量参考标准,（,-,） 胞质,无颗粒,（,+,） 胞质呈,淡红色,，,无颗粒,（,+,） 胞质呈,红色,，有,少量,颗粒,（,+,） 胞质呈,暗红色,，颗粒,较密,（,+,）胞质呈,紫红色,，颗粒,极密,过碘酸,-Schiff,反应,(PAS),（,2,）淋巴细胞系：,大多数淋,巴细胞呈,阴 性,反应，,少数,为（,+,）的,阳性,反应。,淋巴细胞糖原含量程度参考标准,（,-,） 胞质内,无颗粒,（,+,） 胞质内,有颗粒,（,+,） 有,较粗,红色颗粒,（,+,） 有,粗大,红色颗粒,（,+,） 颗粒,粗大,并有,红色块状,（,3,）红细胞系：,幼红,细胞和,红,细胞呈,阴性,反应,红细胞系列糖原含量程度参考标准,（,-,） 胞质无颗粒,（,+,） 有少数红色颗粒,（,+,） 有较粗红色颗粒或弥漫红色,（,+,） 有粗大红色颗粒或深红色,（,+,）有粗大红色块状或紫红色,（,4,）巨核细胞：,巨核,细胞和,血小板,染色反应均为,阳性,巨核细胞糖原含量程度参考标准,（,-,） 胞质无颗粒,（,+,） 少量糖原包涵体,（,+,） 中等量糖原包涵体，定位于核膜 出或分散胞质中，占胞质,1/3,（,+,）大量糖原包涵体分散于胞质的,1/2,（,+,）糖原包涵体充满整个胞质,PAS,巨核细胞,巨核细胞包涵体,（,5,）,单核细胞,呈,阴性,或,阳性,，颗粒细小，往往位于胞质,边缘,；,浆细胞,大多呈,阴性,，少数为红色颗粒阳性；,组织细胞,为,阴性,反应；,巨噬细胞,可呈,阳性,，为红色颗粒反应。,【,临床意义,】,（,1,）,M6,与巨幼贫的鉴别,M6,的幼红细胞,PAS,可呈,强阳性,，积分明显增高，,巨贫,、再障、溶贫时,PAS,反应为,阴性,。,（,2,）急性白血病的类型鉴别,ALL,，,PAS,呈大块状阳性，也可是阴性，,AML,为,阴性,，急性单核细胞白血病时,原单,核细胞及,幼单,核细胞,PAS,阳性,，积分增高，阳性颗粒小而多，呈弥散分布。,ALL-L1,L1 PAS(+),AML-M5,M5 PAS(+),AML-M6,AML-M6 PAS(+),AML-M7,M7 PAS(+),（,3,）巨核细胞,和,Sternberg,细胞鉴别,巨核,细胞,PAS,强阳性,，,Sternberg,细胞为阴性或弱阳性。,（,4,）,戈谢氏细胞强阳性,，,尼曼,-,皮克,细胞,阴性或弱阳性,。,（,5,）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴细胞的糖原积分增高；一般的病毒感染，糖原积分在正常范围内。,四、中性粒细胞碱性磷酸酶染色,偶氮偶联法（,Kaplow,法）,【,原理,】,中性粒细胞胞浆中的,碱性磷酸酶,在,pH 9.29.8,缓冲液中，能水解磷酸萘酚钠，并释放出,磷酸,与,萘酚,。再以,重氮盐,与,萘酚,偶联成不溶性有色,偶氮染料,沉淀于,胞浆,中。,【,结果,】,坚牢蓝,RR,阳性为,紫黑色,颗粒，,坚牢紫酱,GBC,阳性为,棕红色,沉淀。,“一”阴性反应，胞浆中,无,阳性染色颗粒。,“”胞浆中含有,少量,颗粒或呈弥散浅红色（或弥散紫色）。,“,2,”胞浆中含有,中等量,颗粒或弥散受色。,“,3,”胞浆中有,丰富的,颗粒或弥散深色，胞核清晰。,“,4,”有,极丰富,的粗大颗粒，充满胞浆，或弥散深色，胞核不清晰。,中性粒细胞碱性磷酸酶,(NAP),偶氮偶联法,NAP,积分法,计数,100,个成熟中性粒细胞，按其反应强度分级，各级百分率与其级数乘积的总和，即为积分。,例如：,NAP,反应结果（,%,）,（,-,） （,+,） （,+,） （,+,） （,+,）,20 40 20 15 5,积分,=,（,0,20,）,+,（,2,20,）,+,（,3,15,）,+,（,4,5,）,=145,参考值：正常人血细胞碱性磷酸酶除成熟中性粒细胞（杆状核及分叶核）可见阳性外，其他血细胞均为阴性。,中性粒细胞,NAP,活性积分值一般为,10,50,分，但有时可高达,162,分,。,【,临床意义,】,（,1,）生理变化：,新生儿,NAP,增高，成人较儿童减低，老人更低；,激烈运动,增高；,月经期,经前增高，行经后降低，经后期恢复正常；,妊娠期,2-3,月轻度增高，以后逐渐增高，,分娩,时达到高峰，产后恢复正常。,（,2,）、病理变化,增高,：严重,化脓性感染,、类白血病反应、,AA,、,CML,加速期、,ALL,、,CLL,、恶性淋巴瘤、癌转移、,MM,、真红、骨髓纤维化等。,减低,：,PNH,、,CML,、恶性组织细胞病、,MDS,。,（,3,）疾病鉴别诊断,慢粒与类白的鉴别：,CML,减低,，,类白增高,。,急性白血病的鉴别：,AML,减低,，,ALL,增高,。,PNH,与,AA,鉴别：,PNH,减低,，,AA,增高,。,病原微生物的鉴别：,病毒感染减低,，,细菌感染增高,。,NAP (+),CML-NAP(-),五、骨髓铁染色,【原理】,正常人骨髓中的贮存铁主要存在于,骨髓小粒,和,幼红细胞,中，骨髓中的铁在,酸性,环境下与,亚铁氰化钾,作用，形成,普鲁士蓝,反应，形成,蓝色,的,亚铁氰化铁,沉淀，定位于含铁的部位，,从而反映骨髓中铁的储存量。化学反应过程为：,4,Fe,3+,3 K,4,Fe,（,CN,）,6,Fe,4,Fe,（,CN,）,6,3,12 K,+,（,含铁物质）,（亚铁氰化钾）,（亚铁氰化铁）,【结果】,（,1,）,细胞外铁的观察 ：,细胞外铁,呈,蓝色,的颗粒状、小株状或团块状。,以油镜观察定级标准,（,-,） 无铁粒可见。,（,+,） 少数铁粒或铁小珠。,（,+,） 较多铁粒和铁小珠。,（,+,） 很多铁粒、铁小珠和少数小块。,（,+,）极多铁粒、铁小珠并有很多小块，密集成堆。,正常范围：+，“,+”,占,2/3，,“,+”,占,1/3,。,细胞外铁,（,2,）细胞内铁观察：,细胞内铁,指,有核红细胞,胞质,内出现,蓝色,颗粒，以油镜计,100,个中、晚幼红细胞，记录胞质中含有蓝色小颗粒（即,铁粒红细胞,）的比值。并根据细胞铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布情况，将铁粒幼红细胞分为如下四型：,型：仅含,1-2,个铁颗粒。,型：含,3-4,个铁颗粒。,型：含,6-9,个以上铁颗粒。,型：,10,个铁颗粒。,正常范围：30,% 90% ，,平均60,%，,多见,型，少见,型，无,、,型。,细胞内铁,（,3,）,环形铁粒幼红细胞,：,指含铁颗粒,6,个,，其中,2/3,以上,铁颗粒,围绕核周排列成完整环形或不完整,环形,。,正常或非铁粒幼细贫血,无,环形铁粒幼细胞，,铁粒幼细贫血,中环形铁粒幼细胞,6%,。,环形铁粒幼细胞,【临床意义】,1,缺铁性贫血,时，,骨髓细胞外铁明显减少，为,“,一,”,“,士,”,，细胞内铁平均,5.9%,，仅为,I,型。,经有效铁剂治疗后，外铁增多。,因此骨髓铁染色是诊断,缺铁性贫血,及指导,铁剂治疗,的重要方法。,2,铁粒幼细胞性贫血,时，,外铁,“,2,”,一,“,3,”,，内铁平均,70%,，其铁粒粗大，以,型为主，出现较多环形铁粒幼细胞。,因此，本实验是诊断,铁粒幼细胞贫血,的有效方法。,MDS,也可出现环形铁粒幼细胞。,3,. 非缺铁性贫血,如巨幼细胞贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等骨髓铁正常或不同程度的增加。,但再生障碍性贫血不会出现环形铁粒幼细胞，可作为与,MDS,鉴别的参考。,4,. 继发性贫血的部分患者细胞内铁可减少，但细胞外铁不减少。,谢谢！,